BioUnalm

Visit Blog Website

367 posts · 283,159 views

Blog de divulgación y actualidad científica especializado en las ciencias de la vida. Agrupación de Estudiantes de Biología de la Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima, Perú.

David Castro
359 posts

Sort by: Latest Post, Most Popular

View by: Condensed, Full

  • March 27, 2011
  • 10:19 PM
  • 738 views

Niveles de ciertos aminoácidos en sangre podrían predecir si desarrollarás diabetes

by David Castro in BioUnalm

La diabetes es una de las enfermedades metabólicas más comunes en el mundo, la cual afecta a más de 200 millones de personas. Uno puede tener diabetes pero no se dará cuenta de ellos hasta tener los síntomas, que se pueden dar recién a una edad avanzada, por esta razón es necesario tener un método de diagnóstico preventivo para poder hacer frente a la enfermedad antes que los síntomas se manifiesten. Un artículo publicado hoy en Nature Medicine nos muestra un potencial método de diagnóstico preventivo basado en los niveles de cinco aminoácidos en sangre. La diabetes es una enfermedad metabólica que se caracteriza por la incapacidad de las células de tomar la glucosa de la sangre debido a la insensibilidad o ausencia de insulina —la hormona responsable de este proceso. Este trastorno metabólico se debe a que no hay producción de insulina debido a que los linfocitos T destruyen a las células que producen la hormona (células β de los Islotes de Langerhans del páncreas) o a que los receptores de insulina en las células se encuentran dañados. Dependiendo de la causa será el tipo de diabetes. Actualmente, se usan dos indicadores para predecir el riesgo de desarrollar diabetes en las personas. Uno es el índice de masa corporal (IMC), y el otro es la cuantificación de niveles de glucosa en ayunas  o la prueba de tolerancia a la glucosa. Lamentablemente, estos exámenes sólo son eficientes cuando son realizados muy cercana a la fecha de  inicio del desarrollo de la diabetes, así que no sirve para hacer un diagnóstico preventivo, algo que es crucial para que el tratamiento funcione adecuadamente. Ahora, gracias al desarrollo de las técnicas analíticas de alta eficiencia, se puede realizar un perfil metabólico completo en cuestión de horas. Usando estas técnicas podemos estudiar los niveles de determinados sustratos y productos de las reacciones metabólicas al mismo tiempo, y ver si los niveles de algunos de ellos se encuentran más altos o más bajos que los normales, los cuales podrían ser usados como indicadores de algún problema metabólico. El Dr. Thomas J. Wang y colaboradores de la Escuela de Medicina de Harvard fueron al Estudio de Descendencia Framingham, un programa a largo plazo que se inició en los años 1940’s y que buscaba identificar factores comunes o características que contribuyen a las enfermedades cardiovasculares. En este lugar se encontraban almacenadas las muestras de sangre de todas las personas que formaron parte del estudio. Wang et al. seleccionaron a 2,422 personas no diabéticas (según los resultados de sus exámenes de sangre realizados entre 1991 y 1995). De todos ellos, 201 desarrollaron la diabetes en los 12 años posteriores a dichos exámenes. Wang tomó las muestras de sangre almacenadas de estos pacientes y las analizó usando el HPLC-MS (la cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a la espectrometría de masas) para identificar metabolitos asociados al desarrollo de la diabetes. Los resultados mostraron que cinco aminoácidos: tres ramificados (isoleucina, leucina y valina) y dos aromáticos (tirosina y fenilalanina) se encontraban en niveles superiores a los normales, a pesar que los pacientes no presentaran hiperglucemia (elevados niveles de glucosa en sangre) y el valor del IMC era normal. Los niveles de estos aminoácidos se encontraban elevados hasta 12 años antes de desarrollar la diabetes y el riesgo de tener diabetes fue 4 veces mayor en aquellas personas que tenían esta condición. Una de las explicaciones es que ciertos aminoácidos, particularmente los aminoácidos ramificados, son moduladores de la secreción de insulina y tienen la capacidad de alterar su mecanismo de señalización en el músculo esquelético, provocando una resistencia a ella, la cual es una característica de la diabetes tipo II. Así que la hiperaminoacidemia se posiciona como un buen indicador prematuro de la diabetes. Si bien existen ciertos marcadores genéticos de la diabetes asociados a polimorfismos (diferencias en uno o más nucleótidos), su capacidad de predecir el riesgo de desarrollo de diabetes varía entre un 5 y 37% a diferencia de la hiperaminoacidemia, la cual tienen una eficiencia que varía entre el 60 y 100%. De los cinco aminoácidos, la presencia en altos niveles de por lo menos tres de ellos son los que permiten hacer un diagnóstico prematuro de la diabetes. Sin dudas es un gran avance en el diagnóstico prematuro de la enfermedad, pero, lamentablemente, la técnica usada en este trabajo es sumamente costosa que lo haría inviable para usarlo como prueba rutinaria en los hospitales. Por suerte, con el paso de los años, los precios van cayendo considerablemente dando una luz de esperanza para el uso de la metabolómica para el estudio y diagnóstico de otras enfermedades metabólicas. Referencia: Wang, T., Larson, M., Vasan, R., Cheng, S., Rhee, E., McCabe, E., Lewis, G., Fox, C., Jacques, P., Fernandez, C., O'Donnell, C., Carr, S., Mootha, V., Florez, J., Souza, A., Melander, O., Clish, C., & Gerszten, R. (2011). Metabolite profiles and the risk of developing diabetes Nature Medicine DOI: 10.1038/nm.2307 BioUnalm

... Read more »

Wang, T., Larson, M., Vasan, R., Cheng, S., Rhee, E., McCabe, E., Lewis, G., Fox, C., Jacques, P., Fernandez, C.... (2011) Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature Medicine. DOI: 10.1038/nm.2307  

  • November 16, 2011
  • 12:59 AM
  • 737 views

Científicos revelan los colores de una polilla de 47 millones de años de antigüedad

by David Castro in BioUnalm



Nanoestructuras bien preservadas de las escamas fosilizadas permitieron reconstruir los colores. Los colores de los animales no sólo se deben a los pigmentos que producen. Hay algunos que se generan gracias a la interacción física de la luz con nanoestructuras biológicas que cambian la forma como los fotones se reflejan, dispersan, absorben o refractan. A esto se le conoce como color estructural. Como ejemplo tenemos: los colores metálicos que presentan ciertos escarabajos, la iridiscencia de las alas de algunos mosquitos y avispas o los pintorescos colores de las alas de las mariposas. Cuando se observan las escamas de las alas de los Lepidópteros —polillas y mariposas— bajo el microscopio electrónico, se pueden apreciar diminutos relieves formando crestas, valles, costillas arqueadas, poros y hasta cristales fotónicos, de distintos grosores y profundidades. Cada una de estas nanoestructuras presenta un índice de refracción diferente que cambia la forma como la luz se dispersa. Y si a esto le sumamos que las escamas se encuentran superpuestas en las alas, el efecto óptico será mucho más complejo —los haces dispersados interferirán unos con otros reflejando diferentes colores. Estos colores y los patrones que adoptan, cumplen diversas funciones ecológicas, principalmente, en la comunicación visual. La búsqueda de pareja, el aposematismo (defensa contra los predadores a través de la expresión de colores que simbolizan ‘peligro’) o la cripsis (expresar colores similares a los de su entorno para pasar desapercibidos), son algunas de ellas. Sin embargo, la evolución de la coloración estructural aún sigue siendo un misterio. Los datos filogenéticos y estructurales son contradictorios porque, a pesar que las nanoestructuras de las escamas difieren entre una especie y otra, la producción del color se da bajo el mismo fundamento físico: la dispersión coherente de la luz. La única forma de entender los pasos claves en la evolución de coloración estructural sería a través de los fósiles. En un estudio publicado hoy en PLoS Biology, un grupo de investigadores de la Universidad de Yale (EEUU) liderados por la Dra. Maria McNamara, estudiaron la coloración estructural de escamas pertenecientes a polillas fosilizadas hace 47 millones de años, encontradas en los yacimientos de Messel (Alemania). El fósil pertenecía a un espécimen extinto de la sub-familia Procridinae, parte de la familia Zygaenidae. A diferencia de la mayoría de polillas, los zigénidos son diurnos y presentan aposematismo por ser sumamente tóxicos debido a las grandes cantidades de cianuro de hidrógeno que producen. Las imágenes del microscopio electrónico (Fig. D-J) mostraron que las nanoestructuras de sus escamas estaban muy bien preservadas, a pesar que los colores originales se perdieron durante el proceso de fosilización (Fig. A, B y C). Se identificaron con facilidad las crestas con las costillas transversales (Fig. D), otras microcostillas (Fig. E), los poros (Fig. F-G y J), las protuberancias (Fig. H-I), en cada una de las láminas de las escamas superpuestas. Las escamas superiores eran más gruesas que las inferiores generando una geometría cóncava que afectaba la forma como se comportaba la luz. En primer lugar, estas disposición de las escamas funcionaban a manera de un reflector multicapa no ideal (menos del 100% de la luz incidida es reflejada) y junto a las poros suprimían la iridiscencia. Por otro lado, el índice de refracción caía en un rango capaz de dispersar la luz en colores visibles y su forma cóncava permitía verlo de la misma manera a diferentes ángulos. Los colores generados por la dispersión de la luz son reflejados y los picos de reflexión varían en distintos puntos del ala. Para determinar cuáles son las longitudes de onda de los picos reflejados, McNamara y su equipo lo compararon con los patrones observados en lepidópteros modernos. Los resultados mostraron que la mayor parte de las alas eran de color amarillo y verde, degradándose hacia el azul a medida que se llegaba a los bordes. El abdomen también presentaba colores amarillos, mientras que el tórax y los extremos de las alas y del abdomen eran marrones (Figura de portada). No se pudo determinar los colores de la parte ventral (delantera). Al igual que los zigénidos actuales, estas polillas ancestrales eran diurnas. Por otro lado, la presencia de las tonalidades amarillas y verdes sugiere que los colores tenían doble función: el amarillo disuadía a los predadores cuando la polilla se alimentaba del néctar de las flores y el verde le permitía camuflare cuando se encontraba en reposo. Referencia: Maria E. McNamara, Derek E. G. Briggs, Patrick J. Orr, Sonja Wedmann, Heeso Noh, & Hui Cao (2011). Fossilized Biophotonic Nanostructures Reveal the Original Colors of 47-Million-Year-Old Moths PLoS Biology DOI: 10.1371/journal.pbio.1001200 BioUnalm



... Read more »

Maria E. McNamara, Derek E. G. Briggs, Patrick J. Orr, Sonja Wedmann, Heeso Noh, & Hui Cao. (2011) Fossilized Biophotonic Nanostructures Reveal the Original Colors of 47-Million-Year-Old Moths. PLoS Biology. info:/10.1371/journal.pbio.1001200

  • March 21, 2011
  • 09:35 PM
  • 734 views

Uso potencial de los exosomas para el tratamiento del Alzheimer

by David Castro in BioUnalm

Durante los últimos años, se ha avanzado mucho en el uso de pequeñas moléculas de ARN para el tratamiento de ciertas enfermedades. Estas moléculas de ARN están diseñadas para silenciar la expresión de genes involucrados con el desarrollo de la enfermedad, así que su función dependerá de que sean transportados correctamente al tejido indicado, para así evitar reacciones cruzadas con tejidos no específicos, principalmente el hígado quien es el encargado de metabolizar todas las sustancias extrañas que entran al cuerpo. Otra barrera que hay que tomar en cuenta es la respuesta inmunogénica que puede ser activada por la molécula de ARN o por el transportador que se está usando, sobre todo si se quiere usar el agente terapéutico repetidas veces, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades crónicas. Un grupo de investigadores británicos desarrollaron un transportador basado en exosomas los cuales permiten llevar moléculas de ARN de silenciamiento (ARNsi) al tejido cerebral de manera específica y sin producir una respuesta inmunogénica según reportaron ayer en Nature Biotechnology. Los exosomas son pequeñas nanovesículas naturales secretadas por diferentes tipos de células, cuya función es transportar diferentes compuestos y moléculas señalizadoras de un lugar a otro, permitiendo la comunicación celular. Su tamaño varía entre 40 y 100nm y en los últimos años se ha investigado mucho sobre su uso como transportador específico de agentes terapéuticos. En el 2007, Valadi et al. demostraron que los exosomas pueden ser usados para transportar pequeñas moléculas de ARN. Para que un exosoma sea específico para un determinado tejido debe tener en su superficie unas pequeñas moléculas llamadas ligandos, los cuales serán reconocidos por receptores específicos dependiendo del tejido. Estos ligandos son principalmente pequeñas secuencias de aminoácidos llamados péptidos. De esta manera, Álvarez-Erviti et al. aislaron exosomas de la médula ósea de ratones, específicamente de las células dendríticas inmaduras. Los exosomas obtenidos tuvieron un tamaño homogéneo de 80nm de diámetro. Luego, se fusionaron a la superficie de los exosomas péptidos específicos para ser reconocidos por determinados receptores de las células musculares y cerebrales, dos tejidos que sufren de enfermedades degenerativas. Uno de los péptidos reconoce los receptores de acetil colina del sistema nervioso central llamado RVG, otro reconoce ciertos receptores de las células musculares llamado MSP y un tercero evidencia la presencia de los exosomas llamado FLAG-Lamp2b —para poderles hacer un seguimiento. Una vez construido los exosomas con los ligandos específicos, el siguiente paso fue insertar el ARNsi. Para ello usaron una técnica muy usada para insertar fragmentos de ADN en bacterias y protoplastos llamado electroporación [Ver BioUnalm for Dummies #2]. Finalmente, una vez obtenidos los exosomas, con los péptidos específicos para los tejidos musculares y neuronales, y cargando la molécula de ARNsi, probaron si funcionaban en dos líneas celulares: del músculo murino (C2C12) y células neuronales (Neuro2A), que son específicos para los exosomas MSP y RVG, respectivamente. Los resultados de la PCR cuantitativa (determinación de la cantidad del ARNsi) y de la microscopia de fluorescencia (determinación de la unión de los exosomas a las líneas celulares específicas) confirmaron la eficiencia de la técnica in vitro. Como la técnica funcionó, los investigadores quisieron probar un agente terapéutico contra el Alzheimer. Para ello diseñaron un ARNsi contra el gen BACE1, el cual codifica para una proteasa responsable de la formación de la proteína precursora amiloidea, que producen la formación de los agregados de β-amiloide. Cuando analizaron los niveles de BACE1, vieron que el tratamiento con los exosomas lo redujo significativamente. Además, los ensayos de toxicidad demostraron que el producto era inocuo lo que daría pie para hacer los ensayos in vivo. Luego, se diseñaron exosomas portando un ARNsi para un gen que es expresado en todo momento (constitutivo), ya que codifica para la enzima necesaria del sexto paso de la glucólisis —la gliceraldéhído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).  Primero se inyectaron exosomas libres (sin ligandos específicos) vía intravenosa en ratones de laboratorio y se analizaron los niveles de expresión de la GAPDH en los riñones, hígado y bazo. Como era de esperarse, los niveles de esta enzima se vieron afectados significativamente. Cuando se inyectaron los exosomas con los péptidos RVG se observó que los niveles de la enzima GAPDH se redujeron en el cerebro pero no en otros tejidos, quedando demostrada la especificidad de la técnica. Además, determinaron que la readministración de los exosomas no reducía su especificidad y eficiencia. Para esto, inyectaron en los ratones exosomas RVG libres unas semanas antes de inyectar los exosomas con el ARNsi para la enzima GAPDH. Los resultados mostraron que hubo una mínima atenuación pero esta no era significativa, lo que demostraba el uso potencial de lo exosomas en el tratamiento de enfermedades crónicas. Finalmente, probaron si los exosomas desarrollados durante el presente trabajo exosomas serían buenos agentes terapéuticos contra el gen BACE1, responsable del Alzheimer. Para ello usaron ratones modificados para expresar este gen en grandes cantidades y les insertaron lo exosomas portando el ARNsi para BACE1. Los resultados mostraron que la cantidad de ARN mensajero de BACE1 se redujo significativamente y hubo una inhibición de la función de una γ-secretasa, que también responsable de la formación de los β-amiloide. Además, al comparar los niveles de β-amiloide usando los exosomas terapéuticos y los inhibidores de BACE1 que actualmente se usan, la reducción fue mayor usando los primeros. Por otro lado, los investigadores quisieron ver si los exosomas generaban algún tipo de respuesta antigénica, toxicidad u otro efecto secundario, para ello estudiaron las concentraciones de interleucina-6, IP-10, TNF-α y IFN-α. Los niveles fueron normales lo cual indica que los exosomas son seguros ya que no generan algún tipo de respuesta inmunogénica. Este estudio se ve muy prometedor, quedaría ahora hacer unos estudios más cuidadosos en líneas celulares humanas, ver si son seguros para poder empezar con los primeros ensayos clínicos. Sin dudas, con esta tecnología se podría superar uno de los principales inconvenientes de la terapia génica, el transporte del agente terapéutico —en este caso un ácido nucléico— al tejido donde realizará su función, de manera específica. Referencia: ... Read more »

Alvarez-Erviti, L., Seow, Y., Yin, H., Betts, C., Lakhal, S., & Wood, M. (2011) Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature Biotechnology. DOI: 10.1038/nbt.1807  

  • May 5, 2010
  • 01:45 AM
  • 733 views

Haciendo lluvias con láser

by David Castro in BioUnalm

Las sequías son uno de los principales problemas que afectan a la agricultura, costando millones de dólares en pérdidas y no podemos evitarla. El fenómeno del Niño causa sequías en zonas donde siempre fueron húmedas, mientras que causa lluvias e inundaciones en zonas desérticas, algo así como una inversión climática. Pero, no sería fantástico poder controlar las lluvias, hacer que llueva cuando realmente lo necesitáramos. Esto ya está cerca de ser posible. Los científicos han intentado generar lluvias artificiales desde la década de los 40’s. Uno de los métodos más populares era “sembrar” pequeñas partículas de ioduro de plata en las nubes. ¿Pero que tienen que ver estás partículas con las lluvias? Todos nosotros sabemos que las nubes son grandes masas de vapor de agua que se juntan y se mueven debido a los vientos. Sin embargo, alguna vez se han puesto a pensar por qué el vapor de agua no se condensa —o en el mejor de los casos, se congela— si las temperaturas a esas alturas son muy bajas, a veces por debajo del punto de fusión del agua (0°C)?. La respuesta es que el vapor de agua puede estar a muy bajas temperaturas y aún así mantenerse en estado gaseoso, esto porque requieren de una superficie para iniciar el proceso de condensación; sin un soporte, el agua no puede condensarse. Una forma más fácil de entenderlo es cuando nos tomamos una ducha con agua caliente en invierno, nuestro baño se inunda de vapor pero sólo se condensa en las paredes, cortinas, ventanas y espejos, nunca cae como lluvia, esto mismo ocurre en las nubes. Así que, al bombardear las nubes con partículas, en este caso de ioduro de plata, lo que estamos haciendo es dar un soporte para que el agua se condense y caiga como lluvia. En 1911, un físico llamado Charles Wilson, hacía mediciones de los rayos cósmicos —partículas subatómicas altamente energéticas— usando un aparato llenado con vapor de agua (detector). Wilson observó que cuando los rayos cósmicos atravesaban el detector dejaban una estela visible de gotitas de agua tras su trayectoria… había una condensación! Esto ocurría porque el rayo cósmico chocaba con las moléculas de agua y le quitaba un electrón (las ionizaba), y cuando la molécula de agua tiene carga actúa como si fuera una partícula de polvo y las demás moléculas de agua empiezan a condensarse a su alrededor. La molécula de agua ionizada actúa como si fuera una superficie. Este mecanismo fue aprovechado por Rohwetter et al. quienes pensaron que si se daba la condensación del agua con los rayos cósmicos o fotones de alta energía, también podrían darse con rayos láser de gran potencia. Así que, primero diseñaron un experimento de laboratorio bombardeando con un láser infrarrojo —a una longitud de onda de 800nm y a 3.5 TW (3.5 trillones de wats) de potencia— una nube artificial dentro de una cámara cerrada. Observaron que inmediatamente después del bombardearla con el láser (Fig. a y b), la niebla empezaba a formar pequeñas gotitas de agua condensada de unos 50 micrómetros (um) de diámetro y que crecían a 80um en los siguientes tres segundos. Hasta aquí el experimento se veía bastante prometedor. a. Antes de bombardearlo con el laser. b. Después. Así que intentaron reproducir este experimento “in vivo”, o sea, bombardeando con el láser una nube de verdad. Así que durante varias noches del tercer trimestre del 2008 apuntaron con un láser de gran potencia (“Teramobile”) hacia el cielo. Debido a la distancia de las nubes no pudieron apreciar si había o no condensación del agua. Usaron un segundo láser para confirmar la formación de las gotitas de agua. Si bien encontraron que había un cierto grado de condensación del agua, no era capaz de generar una lluvia artificial. Sin embargo ha sido un gran avance hacia el control de las lluvias la cual tendrá grandes implicancias en la agricultura y otros sectores económicos. El estudio en laboratorio también demostró que se podría condensar el agua en la atmósfera así aún no esté saturada de agua. Pero, si se sigue desarrollando esta tecnología, en pocos años podremos generar nubes y lluvias en cualquier parte del mundo. Referencia: Rohwetter, P., Kasparian, J., Stelmaszczyk, K., Hao, Z., Henin, S., Lascoux, N., Nakaema, W., Petit, Y., Queißer, M., Salamé, R., Salmon, E., Wöste, L., & Wolf, J. (2010). Laser-induced water condensation in air Nature Photonics DOI: 10.1038/nphoton.2010.115 BioUnalm

... Read more »

Rohwetter, P., Kasparian, J., Stelmaszczyk, K., Hao, Z., Henin, S., Lascoux, N., Nakaema, W., Petit, Y., Queißer, M., Salamé, R.... (2010) Laser-induced water condensation in air. Nature Photonics. DOI: 10.1038/nphoton.2010.115  

  • January 21, 2011
  • 02:58 PM
  • 733 views

¿Cómo entra el parásito de la malaria a los glóbulos rojos?

by David Castro in BioUnalm

La malaria es uno de los más grandes problemas que aqueja a la salud pública mundial. Millones de personas en el mundo, principalmente en la zonas tropicales, son infectadas por este parásito cada año. El causante de esta enfermedad es un protozoario del género Plasmodium (principalmente P. falciparum) el cual es transmitido por la picadura de un mosquito. Cuando entra a nuestro torrente sanguíneo, en la etapa asexual de su ciclo de vida (merozoito), se adhiere e ingresa a los eritrocitos (glóbulos rojos) donde se divide y se disemina por todo el cuerpo, infectando a más eritrocitos y provocando los graves síntomas por los cuales se caracteriza la enfermedad.
Como la invasión del eritrocito es parte fundamental para desarrollo del ciclo de vida del parásito, las investigaciones hacia la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos se están enfocando en este mecanismo. ¿Pero como se da? Gracias al uso de la microscopía electrónica, se han determinado las etapas de invasión del parásito en el eritrocito:

Como pueden ver, primero el merozoito se une a la superficie del eritrocito (1), luego se acomoda de tal manera que sus roptrias apunten hacia la membrana del eritrocito (2) y se forman las uniones oclusivas o "tight junctions" (3). Luego, la membrana celular del eritrocito se invagina, gracias a las enzimas liberadas por las roptrias, permitiendo el ingreso del parásito hacia una vacuola (4–9). Sin embargo, las imágenes capturadas con el microscopio electrónico sólo nos dan una visión superficial del proceso, pero no nos dicen nada acerca de las moléculas que podrían estar involucradas en el mismo.
Fue así que investigadores australianos liderados por el Dr. David T. Riglar usaron los ensayos de inmunofluorescencia e iluminación estructurada 3D para relacionar estos eventos estructurales con los eventos moleculares. De esta manera pudieron registrar y entender cómo el mecanismo de ingreso de P. falciparum a los glóbulos rojos a nivel molecular. El trabajo fue publicado ayer en la revista Cell Host & Microbe.
Lo que hicieron Reglar et al. fue marcar —con una molécula fluorescente verde— una proteína envuelta en la formación de las uniones oclusivas. Esta proteína fue predicha a partir de su homólogo en otro parásito que invade los eritrocitos, la Toxoplasma gondii, causante de la toxoplasmosis.

Como se puede ver en la imagen, la proteína PfRON4 de P. falciparum es la responsable de formar las uniones oclusivas, luego forma una especie de anillo gracias a las enzimas secretadas por las roptrias, y por ahí penetra el merozoito, que es visualizado de color azul, que es una molécula fluorescente que se une al ADN. Con estas imágenes hicieron una reconstrucción en 3D.
Pero, ¿cómo hace el parásito para reconocer al eritrocito?  A nivel celular, todo reconocimiento se da bajo las proteínas específicas de superficie de membrana. Los eritrocitos poseen unas proteínas receptoras específicas que las diferencia de otro tipo celular. Entonces, P. falciparum debe tener una proteína capaz de reconocer los receptores de la superficie del eritrocito. Esta proteína es la PfAMA1 y se encuentran en los micronemos. Así que para que se de la infección, PfAMA1 y PfRON4 deben interactuar, una para reconocer y unirse a la superficie del eritrocito y el otro para crear las uniones oclusivas y abrir el anillo por donde entrará en parásito.
Así que, Reglar et al. esta vez marcaron a la PfAMA1 con una molécula fluorescente roja para ver como se relacionaba con PfRON4 (verde). Las imágenes de la microscopía fluorescente mostraron que PfAMA1 está ubicado directamente en el anillo de PfRON4, de esta manera se confirma que las dos proteínas forman un complejo que permite la invasión de merozoito al eritrocito. Para ser precisos, la PfAMA1 reconoce a las glicoporinas A, que son los receptores de superficie de los eritrocitos.

Como pueden ver, todo el proceso se da en menos de 10 minutos. Además, para determinar como se da este mecanismo de invasión paso a paso a nivel molecular, analizaron la función y la ubicación espacio-temporal de proteínas asociadas a las roptrias como la RAP1 y RESA.
Los investigadores también estudiaron que era lo que pasaba cuando usaban ciertos inhibidores. Por ejemplo, cuando usaban el péptido R1 se bloqueaba la formación del complejo PfRON4/PfAMA1, provocando que no se de las uniones oclusivas. Por otro lado, cuando usaban Citocalasina D, la cual se une a los filamentos de actina, se repimía su movilidad; o cuando usaban la molécula PMSF, la cual es una inhibidora de proteasa, el contenido de las roptrias eran liberadas de manera aberrante. Con todos estos datos, los investigadores propusieron el siguiente modelo: 

[Click para agrandar]
El uso de estos inhibidores indica que el proceso de invasión es irreversible, una vez que el merozoito hace el primero contacto con el eritrocito. Esto sería una gran ventaja al momento de diseñar agentes terapéuticos. Además, gracias a este conocimiento en detalle de la ubicación espacio-temporal de moléculas claves para el proceso invasivo de P. falciparum nos da una plataforma para poder probar estrategias que ayuden a bloquear este proceso y desarrollar vacunas que nos permitan combatir esta enfermedad que infecta a millones de personas cada año.
Referencia:

Riglar, D., Richar... Read more »

Riglar, D., Richard, D., Wilson, D., Boyle, M., Dekiwadia, C., Turnbull, L., Angrisano, F., Marapana, D., Rogers, K., & Whitchurch, C. (2011) Super-Resolution Dissection of Coordinated Events during Malaria Parasite Invasion of the Human Erythrocyte. Cell Host , 9(1), 9-20. DOI: 10.1016/j.chom.2010.12.003  

  • February 16, 2011
  • 05:59 AM
  • 733 views

¿Los receptores olfativos reconocen la forma de las moléculas o las vibraciones moleculares?

by David Castro in BioUnalm

Si les pregunto… ¿Cuál de todos tus sentidos es el más importante? Les aseguro que casi el 100% me dirá la vista. Para muchos quedar ciegos es lo peor que nos podría pasar en la vida, y tal vez sea cierto, porque casi todo lo que hacemos depende de ella. Para otros animales, el oído será el sentido más importante, sobre todo para aquellos que viven en las profundidades del mar o para los que se valen del sonar para poder cazar o de la ecolocalización para poder orientarse. Para otros animales, el más importante será el olfato, ya que gracias a él pueden detectar las moléculas que hay en el entorno (feromonas) y poder encontrar una pareja con quien aparearse. En los humanos, hemos despreciado mucho al sentido del olfato. Sin embargo, para muchos biólogos evolutivos, este sentido es uno de los más importantes, tal vez tan importante como lo es el sentido de la vista. En primer lugar, un olor puede evocar muchos más recuerdos que una imagen o un sonido. Y en segundo lugar, un gran porcentaje de los sabores que sentimos se dan gracias al sentido del olfato y no del gusto. Esto lo podemos demostrar fácilmente al taparnos la nariz y tomar un sorbo de café y uno de té. No podremos distinguir la diferencia entre ellos. Otro ejemplo es cuando tomamos un jarabe muy feo, al taparnos la nariz pasará desapercibido. Cuando estamos resfriados y con la nariz tapada, las comidas nos sabrán insípidas. El cebiche no será el mismo si nos tapamos la nariz. A pesar de ser un sentido muy importante, sabemos poco acerca de su funcionamiento. De manera sencilla, la principal teoría que explica cómo olemos dice que cada molécula o parte de ella (odotipos) es reconocida en base a su forma (disposición de sus átomos) por un receptor en particular, formando u mecanismo tipo ‘llave-cerradura’. Sin embargo, la principal falla de esta teoría es que podemos captar decenas de miles de olores diferentes sólo con unos cientos de receptores, ¿cómo puede ser posible esto bajo un mecanismo de llave-cerradura? Otra falla en la teoría es que moléculas con estructuras muy similares tienen olores completamente diferentes. Una teoría alternativa para explicar como los receptores olfativos reconocen un olores se basa en las vibraciones de los átomos o de los grupos funcionales que conforman una molécula. Reemplazando los átomos de hidrógeno por deuterio, sería una buena forma de probar esta teoría. El deuterio es un isótopo del hidrógeno el cual tiene un neutrón y un protón en el núcleo, volviéndolo el doble de pesado que el hidrógeno y afectando la vibración molecular. A pesar de la sutil diferencia entre el hidrógeno y el deuterio, las propiedades químicas de ambos isótopos son las mismas. Esto quiere decir que la molécula que posea deuterio en vez de hidrógeno tendrá las mismas propiedades químicas que la molécula original. Entonces, si la molécula deuterada y no deuterada posee las mismas propiedades químicas y estructurales, no debería haber diferencia entre ellas al momento de olerlas si la teoría de llave-cerradura es la correcta. Sin embargo, científicos griegos liderados por la Dra. María Isabel Franco, demostraron que la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) tiene la capacidad de distinguir el olor de una misma molécula deuterada y no deuterada, según reportaron el día lunes en PNAS. Para probar la hipótesis de las vibraciones moleculares, los investigadores usaron un compuesto comercial llamado aceptofenona (ACP). La ACP también fue comprada en sus versiones deuteradas, las cuales tenían 3, 5 y 8 átomos de deuterio reemplazando a los hidrógenos. Las cuatro versiones del ACP fueron diluidos y puestos en dos extremos de un pequeño laberinto en forma de ‘T’. Las moscas se sintieron atraídas por el compuesto así que compararon la respuesta hacia el ACP normal con los deuterados. Los resultados mostraron que las moscas tenían la capacidad de distinguir entre las dos versiones de la ACP, y cuanto más deuterada se encontraba, más se alejaban de ella. Además, se obtuvo el mismo resultado cuando se usó 1-octanol normal y deuterado, y también cuando usaron benzaldehido normal y deuterado. Las moscas distinguían estos dos tipos de moléculas y en casi todos los casos no les gustaba la versión deuterada de la molécula. Para corroborar estos resultados, los investigadores entrenaron a las moscas para que evitaran escoger una de las dos moléculas a través de una descarga eléctrica. Por ejemplo, cada vez que la mosca elegía la ACP normal recibía una descarga eléctrica. Así que cuando pusieron en el laberinto la versión deuterada con la normal, las moscas elegían la versión deuterada, a pesar que en el primer experimento no lo hacían. Esto demostraba que las moscas eran capaces de distinguir entre los dos olores. Si bien en humanos no se ha demostrado la capacidad de distinguir el olor de moléculas deuteradas y no deuteradas, este artículo ofrece una buena evidencia que indicaría que la teoría de las vibraciones moleculares es la correcta. Aunque ha científicos que se mantienen escépticos ya que creen que las moscas tienen la capacidad de distinguir entre una molécula deuterada y otra no deuterada, sin la necesidad de que las vibraciones moleculares jueguen un papel crucial en este echo. Para responder a esta crítica, los científicos diseñaron otro experimento en el cual se reemplazó los enlaces carbono-deuterio  (C-D) por grupos nitrilo (C≡N), los cuales poseen una vibración similar. Cuando a las moscas entrenaron para que la mosca relacionara la descarga eléctrica con la versión normal de la molécula y luego las sometieron al laberinto confrontando las versiones deuteradas y nitriladas, las moscas no pudieron encontrar diferencia significativas entre ellas, dando un punto a favor a la teoría de las vibraciones moleculares. Bueno, el estudio se ve bastante prometedor, pero no significa que nuestro sentido del olfato funcione de esta manera, aunque si ayudaría a resolver ciertas interrogantes. Se debe hacer experimentos similares en humanos, pero dichos experimentos deben ser bien diseñados ya que nosotros no podemos distinguir entre una forma normal y una deuterada, ya que nuestros receptores olfatorios no son tan sensibles. Aunque los perros, quienes también tienen buenos receptores olfatorios, tampoco pueden discriminar entre una y otra molécula, lo cual indicaría que hay algo más que aún nos falta entender. Referencia: Franco, M., Turin, L., Mershin, A., & Skoulakis, E. (2011). Molecular vibration-sensing component in Drosophila melanogaster olfaction Proceedings of the National Academy of Sciences DOI: 10.1073/pnas.1012293108 BioUnalm
... Read more »

Franco, M., Turin, L., Mershin, A., & Skoulakis, E. (2011) Molecular vibration-sensing component in Drosophila melanogaster olfaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. DOI: 10.1073/pnas.1012293108  

  • May 21, 2010
  • 02:53 AM
  • 730 views

En busca de nuevos compuestos antimaláricos

by David Castro in BioUnalm

La malaria es una enfermedad que afecta a cientos de millones de personas en el mundo. Durante la mayor parte del siglo XX, se ha combatido esta enfermedad con drogas de rápido efecto y bajos precios como la cloroquina y la sulfadoxina-pirimetamina; sin embargo, desde los años 60’s, estas drogas han sucumbido a la aparición de Plasmodium resistentes a estas drogas, las cuales se han diseminado por todo el mundo. En los años 90’s, el 50% de las muertes infantiles en África se debían al P. falciparum. Actualmente, los tratamientos se basan en terapias combinadas con derivados de la artemisina; y junto al uso de insecticidas para controlar la población de mosquitos, se ha ido reduciendo la incidencia de esta enfermedad, pero aún así, es muy alta. Es así que Gamo et al. probaron la capacidad antimalárica —inhibidores del ciclo intra-eritrocítico— de aproximadamente 2 millones de compuestos diferentes obtenidos de la librería química de GlaxoSmithKline. (Este experimento se parece mucho al realizado por Min Gao et al. para buscar inhibidores de la replicación del HCV). Gamo describió 13533 compuestos diferentes que inhibían más del 80% del crecimiento del parásito usando una concentración de sólo 2uM. El 15% presentaron signos de toxicidad en cultivos de células hepáticas y el 82% eran de propiedad de la empresa farmacéutica, así que eran desconocidos para la comunidad científica. Sin embargo, a fin de encontrar nuevos compuestos antimaláricos, se han puesto estás moléculas a libre disposición de cualquier investigador en el mundo. Al probarlos en la cepa Dd2, la cual es resistente a muchas drogas derivadas de las quinolinas y antifolatos, ~8000 presentaron un efecto inhibitorio superior al 50% y sólo ~2000 no mostraron actividad alguna en células hepáticas. Todos los compuestos seleccionados se agruparon según su estructura y propiedades químicas. Se encontró que dos grupos actuaban sinérgicamente con los derivados de la arteminisa, lo cual es muy favorable y beneficioso para el control de la enfermedad porque evitamos que el Plasmodium adquiera resistencia rápidamente. Además, se probaron los compuestos seleccionados en otros parásitos patogénicos: Toxoplasma, Leishmania y Trypanosomas, y encontraron que la mayoría de ellos eran específicos para el Plasmodium. Al determinar las propiedades farmacocinéticas de los compuestos (absorción, eliminación y distribución en el organismo), los investigadores quedaron muy satisfechos. Gamo encontró que muchos de los compuestos antimaláricos encontrados en este estudio tenían una actividad sobre las enzimas kinasa del Plasmodium. Además, estos datos pueden ser usados para el tratamiento de enfermedades producidas por desórdenes de las kinasas como ciertos tipos de cánceres y tumores, artritis, diabetes y enfermedades cardiovasculares. Otro lugar donde tienen efecto es a nivel de las interacciones celulares entre el hospedero y el patógeno. Este estudio no es concluyente, más bien es el punto de inicio para el desarrollo de nuevos compuestos antimaláricos más efectivos que los anteriores. Toda esta base de datos esta disponible para cualquier investigador en European Bioinformatics Institute’s ChEMBL, con el fin de animar a los científicos de todo el mundo a encontrar alguno que tenga la capacidad de erradicar esta enfermedad del mundo. Para seleccionar un compuesto y ser probado en pacientes, primero debe cumplir con algunos requisitos: debe ser fácil de sintetizar, económico, efectivo en animales modelo como ratas, ratones y monos, seguros y no deben ser afectados por los mecanismos de resistencia de los Plasmodium actuales, no solo aquellos que causan la malaria, sino en especies de vida silvestre que podrían ser una fuente de resistencia para ser usado en cualquier momento. Referencia: Gamo, F., Sanz, L., Vidal, J., de Cozar, C., Alvarez, E., Lavandera, J., Vanderwall, D., Green, D., Kumar, V., Hasan, S., Brown, J., Peishoff, C., Cardon, L., & Garcia-Bustos, J. (2010). Thousands of chemical starting points for antimalarial lead identification Nature, 465 (7296), 305-310 DOI: 10.1038/nature09107 BioUnalm

... Read more »

Gamo, F., Sanz, L., Vidal, J., de Cozar, C., Alvarez, E., Lavandera, J., Vanderwall, D., Green, D., Kumar, V., Hasan, S.... (2010) Thousands of chemical starting points for antimalarial lead identification. Nature, 465(7296), 305-310. DOI: 10.1038/nature09107  

  • November 24, 2011
  • 11:13 PM
  • 730 views

Parásito de la enfermedad de Chagas ayudaría a combatir el cáncer

by David Castro in BioUnalm



Científicos usan a Trypanosoma cruzi para transportar antígenos de ciertos tipos de cáncer e inducir la respuesta inmune mediada por las células-T. Muchas de las vacunas que hoy conocemos están hechas a base de virus o bacterias atenuadas (agentes infecciosos modificados para no ser virulentos) quienes, al entrar al cuerpo, generan una respuesta inmune que es “recordada” para cuando la verdadera infección ocurra. El mejor ejemplo que tenemos de ello es la vacuna contra la parálisis flácida aguda (PFA) o polio. Esta estrategia consiste en que el agente infeccioso atenuado infecta las células sin llegar a proliferarse. Una vez dentro, expresan sus antígenos de superficie que son reconocidos por los linfocitos-T CD8+ quienes activan la apoptosis (muerte celular). El anticuerpo contra este antígeno queda “memorizado” y permite una respuesta rápida y eficiente cuando la verdadera infección se presente. Entonces, ¿podemos considerar a las células cancerosas como agentes infecciosos para desarrollar vacunas contra ellas?. Sí, porque las células cancerosas también expresan antígenos específicos dependiendo de su origen. Uno de ellos es el antígeno NY-ESO-1, que pertenece a la familia de los antígenos cáncer/testículo (CTA, por sus siglas en inglés). Este antígeno está siendo muy investigado por su capacidad de generar anticuerpos y activar la respuesta inmune mediada por las células T en diferentes pacientes con cáncer. En la actualidad hay más de 30 ensayos clínicos en todo el mundo que buscan usarlo como agente terapéutico (inmunoterapia del cáncer) o como profiláctico (vacuna). Sin embargo, el problema de usar virus o bacterias atenuadas para transportar este antígeno es que no generan una respuesta inmune persistente. La explicación es que al estar atenuados no proliferan y el reconocimiento de los antígenos por parte de los linfocitos-T se pierde una vez la infección sea eliminada. Un grupo de investigadores brasileños liderados por la Dra. Caroline Junqueira de la Universidad Federal de Minas Gerais han logrado superar este problema usando una cepa atenuada del parásito Trypanosoma cruzi —protozoario causante de la enfermedad de Chagas— para transportar el antígeno NY-ESO-1, demostrando su capacidad y eficiencia para activar la respuesta de los linfocitos-T CD8+ in vitro y proteger o retardar el crecimiento de tumores en ratones. Los resultados aparecen publicados en PNAS. Junqueira y sus colaboradores usaron T. cruzi porque es un parásito intracelular que tiene la capacidad de generar una fuerte y persistente respuesta inmune mediada por los linfocitos-T. T. cruzi es un inductor de los linfocitos-T CD4+ (linfocitos-T colaboradores) a través del reconocimiento de los receptores tipo-Toll (TLR). Estos linfocitos son claves en la respuesta inmune adaptativa. Además, persiste y se divide en citoplasma de la célula hospedera manteniendo la respuesta inmune activa por más tiempo y expresando los antígenos que son reconocidos por los linfocitos-T CD8+. Los investigadores crearon cepas de T. cruzi CL-14 (versión altamente atenuada) portando el gen que codifica el antígeno NY-ESO-1 junto al gen de la tubulina (un gen con ~40 copias en el genoma del protozoario y que es altamente expresado). El parásito transgénico logró expresar los antígenos en dos líneas celulares humanas y además indujeron la respuesta de los linfocitos-T CD4+ y CD8+ in vitro. Luego, Junqueira y su equipo quisieron ver la capacidad del T. cruzi transgénico de generar la respuesta inmune in vivo, para esto usaron ratones de laboratorio. Los ratones fueron vacunados dos veces —la segunda vez 30 días después de la primera— y mostraron altos niveles de anticuerpos específicos contra NY-ESO-1 y del interferón gamma (IFN-γ) generados por los linfocitos-T CD4+ que inducen la respuesta de los macrófagos. Los ratones que fueron vacunados mostraron estar protegidos contra el desarrollo de tumores generados por el trasplante de células cancerígenas de melanomas (B16F10), nunca se formaron tumores (ver imagen inferior central) y la mortalidad se redujo prácticamente a cero. En un segundo experimento in vivo, los científicos quisieron determinar el efecto terapéutico del parásito transgénico, para ello usaron dos cepas de ratones (C57BL/6 y BALB/c) a quienes se les trasplantó células cancerosas del tejido conectivo (fibrosarcoma) y del colon (adenoma de colon) con el fin de generar tumores. Luego, los ratones fueron vacunados repetidas veces con los parásitos transgénicos, mostrando un retardo del 30% en el crecimiento de los tumores y un aumento del 50% en la esperanza de vida. Si bien el T. cruzi es bastante sensible a drogas como el benznidazol, Junqueira et al. le insertaron el gen de la timidin kinasa del virus de herpes para volverlo sensible al aciclovir, esto con el fin de facilitar la eliminación al parásito una vez haya cumplido su objetivo. Sin dudas son resultados muy alentadores, ya que se demostró tanto el efecto terapéutico y profiláctico de esta nueva estrategia de transporte del antígeno NY-ESO-1 para la activación de la respuesta inmune mediada por los linfocitos-T y prevenir así el desarrollo de tumores o retardar su crecimiento y aumentando la esperanza de vida. Además, se pueden insertar otros antígenos específicos para crear vacunas polivalentes que permitan protegernos contra diferentes tipos de cáncer. Aún falta mucho por investigar, pero el hecho que haya funcionado tanto en ratones como en líneas celulares humanas es una gran motivación para seguir trabajando y financiando este tipo de investigaciones, sobre todo las que son hechas en América Latina. Referencia: Caroline Junqueira, Luara I. Santos, Bruno Galvão-Filho, Santuza M. Teixeira, Flávia G. Rodrigues, Wanderson... Read more »

Caroline Junqueira, Luara I. Santos, Bruno Galvão-Filho, Santuza M. Teixeira, Flávia G. Rodrigues, Wanderson D. DaRocha, Egler Chiari, Achim A. Jungbluth, Gerd Ritter, Sacha Gnjati.... (2011) Trypanosoma cruzi as an effective cancer antigen delivery vector. Proceedings of the National Academy of Sciences. info:/10.1073/pnas.1110030108

  • September 1, 2011
  • 12:27 AM
  • 728 views

Scale—volviendo los tejidos transparentes

by David Castro in BioUnalm



Uno de los retos más grandes dentro de las investigaciones biológicas es poder ver las células que conforman los tejidos internos de los animales entre tres dimensiones y con una resolución que hasta ahora sólo era obtenida con animaciones computarizadas. Un grupo de investigadores japoneses han desarrollado una novedosa solución acuosa llamada Scale que permite volver los tejidos en estructuras ópticamente transparentes, sin perder su forma ni función. Además, han usado esta sustancia para estudiar a fondo el cerebro de ratones a una escala subcelular y con una resolución sin precedentes. El artículo fue publicado ayer en Nature Neuroscience. Una de las cosas más difíciles es observar la disposición estructural y la geometría que adoptan las células en los tejidos que forman órganos como el hígado, los riñones o el cerebro. Una de las formas de obtener imágenes tridimensionales es usando técnicas de tomografía por resonancia magnética, la cual carece de una resolución a nivel celular y subcelular. Otra forma es rebanando (seccionando) un determinado tejido en tajadas sumamente delgadas y observándolas bajo un microscopio electrónico. Si bien esta última técnica permite reconstruir la estructura tridimensional de un tejido, el proceso es sumamente laborioso y costoso —sólo se puede analizar una pequeña porción de un determinado tejido. El seccionamiento óptico usando proteínas fluorescentes permite acelerar el proceso y reducir los costos. Sin embargo, su poder de penetración está limitado por la dispersión de la luz. Por ejemplo, la microscopia de escaneo láser confocal sólo tiene un poder de penetración de 150um, mientras que la microscopía de excitación de dos fotones puede alcanzar los 800um. Si nos preguntamos cómo podríamos solucionar el problema de la dispersión de la luz la respuesta más lógica sería incrementando la transparencia de los tejidos, para que la luz pueda penetrar más distancia antes de refractarse. En el mercado existen sustancias que clarifican los tejidos, por ejemplo, el FocusClear® —muy costoso para grandes muestras. También existen otras más caseras como la sucrosa al 60% con PBS o el BABB (una mezcla de alcohol bencílico y benzoato bencílico), la cual es más usada por su facilidad y bajo costo. Sin embargo, estas técnicas pueden interferir y atenuar la fluorescencia o muchas veces no vuelven los tejidos lo suficientemente transparentes como para hacer buenos estudios tridimensionales. Un grupo de investigadores japoneses liderados por el Dr. Hiroshi Hama desarrollaron una solución llamada Sca/e, la cual está compuesta por urea 4M, glicerol 10% y Triton X-100 0.1%. [Creo que estos insumos están presentes en cualquier laboratorio]. Hama y sus colaboradores probaron el Scale en embriones de ratones y obtuvieron la imagen ubicada al inicio de esta entrada. Para probar si la fluorescencia era atenuada por la solución de Scale, los investigadores probaron la técnica de clarificación en una línea celular humana (HeLa). Los resultados mostraron que la fluorescencia no era atenuada. Una vez obtenidos estos resultados, probaron la técnica in vivo. Para ello usaron una línea de ratones transgénicos (YFP-H) con la capacidad de expresar la proteína amarilla fluorescente (YFP) en las neuronas. Usando el microscopio de excitación de dos fotones lograron hacer la reconstrucción tridimensional hasta una profundidad de 4mm! Pero, cuando se marcó fluorescentemente de manera exclusiva un cierto grupo de neuronas, el poder de penetración fue mucho mayor. Hama et al. marcaron los axones de las neuronas del corpus callosum, que es el encargado de comunicar ambos hemisferios del cerebro. Para ello usaron el Microscopio Macro Confocal AZ-C1 de NIkón y lograron obtener imágenes a una profundidad de 35mm. Con esto queda demostrado los usos potenciales de esta técnica, sobre todo para revelar cómo se ensambla el sistema nervioso y como se forman las conexiones interneuronales —también conocido como el conectoma— en el cerebro. Por ejemplo, Hama y sus colaboradores usaron otra proteína fluorescente, esta vez roja, para estudiar la asociación de las vasos capilares con las células madre neuronales. También se usaron otras técnicas específicas de marcación fluorescente para observar otros arreglos neuronales en el cerebro. Las posibilidades de visualización son muchas. Los investigadores desarrollaron también otras variantes del Scale, usando diferentes concentraciones de glicerol para reducir la expansión observada en los tejidos sometidos al Scale original. Por otro lado, usando urea más concentrada se lograba reducir el tiempo de clarificación de varias semanas y hasta meses, a tan sólo una semana. Además, la clarificación con Scale es reversible ya que bastaba con un lavado con PBS para restaurar la opacidad original del tejido. Sin dudas, es un procedimiento sencillo y económico que ayudará a entender más a fondo el desarrollo y función del cerebro en los animales superiores. Además, Scale nos ayudará a ver cómo se organizan las neuronas y cómo interactúan entre ellas en el cerebro, sin la necesidad de seccionarlo. La conectómica ahora tiene un gran aliado. Referencia: ... Read more »

Hama, H., Kurokawa, H., Kawano, H., Ando, R., Shimogori, T., Noda, H., Fukami, K., Sakaue-Sawano, A., & Miyawaki, A. (2011) Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. DOI: 10.1038/nn.2928  

  • April 28, 2010
  • 05:33 PM
  • 726 views

Podrían los microbios de la Tierra contaminar Marte?

by David Castro in BioUnalm

Imagínense esta situación… Dentro de unos 135 años, la primera colonia humana se instala en el “planeta rojo”, ya en los últimos años llegaron sondas espaciales cargando los primeros componentes de la estación de investigación marciana. Son cinco los astronautas que llegan para formar esta primera colonia humana permanente, se quedarán ahí por un año investigando las posibles formas de vida que pudieron haber existido en Marte, hasta que sean relevados por un segundo grupo de astronautas. A los pocos días uno de ellos se pone muy grave y sin un hospital y sólo con algunos medicamentos para los posibles enfermedades que podrían contraer como algunas infecciones estomacales —porque se supone que es un planeta estéril, sin agentes infecciosos más los que llevan en el cuerpo cada uno— el primer astronauta muere, y a los pocos días los demás se ponen igual de graves y todos mueren. El segundo grupo de astronautas que llegan investigan las causas de la muerte y se dan con la sorpresa de que es la enterobacteria Serratia la causante del daño. Pero al salir de la Tierra, no mostraban signos de infección con Serratia y sus muestras de heces mostraban una baja concentración de este enteropatógeno, ¿como se infectaron? Salen a investigar y se dan con la sorpresa que el suelo marciano esta infestado con pequeñas colonias de Serratia y E. coli. ¡Hay vida en Marte!, pero es nuestra… ¿Que pasó?… Las sondas espaciales que llegaron a Marte desde el siglo XX no estaban bien esterilizadas y contaminaron en “planeta rojo”. Un artículo publicado en la revista Applied and Environmental Microbiology demuestra que las bacterias comúnmente asociadas a las naves y sondas espaciales —Escherichia coli y Serratia liquefaciens— son capaces de sobrevivir al ambiente extremo de Marte, lo suficiente como para contaminarlo con vida terrestre. Ya se conocía que estas bacterias pueden crecer a bajas presiones atmosféricas (~2.5kPa). Sin embargo, el suelo marciano además se caracteriza por su alta salinidad y bajas temperaturas. Así que los investigadores de la Universidad Central de Florida diseñaron medios de cultivos y ambientes combinando estas características. Evaluaron la supervivencia y replicación de estas dos especies de bacterias a diferentes temperaturas (5, 10, 20 y 30°C) con concentraciones de 0, 5, 10 y 20% de tres diferentes sales (MgCl2, MgSO4 y NaCl). Como era de esperarse, se obtuvo altas tasas de crecimiento a temperaturas de 20 y 30°C y concentraciones de sal de 0 y 5%. En las otras condiciones —temperaturas más bajas y altas concentraciones de sal— no hubo un incremento en la densidad celular de las dos especies, con excepción de 10% de MgSO4 a 20 y 30°C. Hasta ahora no tiene mucho de extraño estos resultados ya que son casi las condiciones en las que pueden vivir estos microorganismos en nuestro planeta, en la superficie de Marte las condiciones son más duras; sin embargo, todas tuvieron una tasa de crecimiento significativa a presiones muy bajas (2.5 y 10kPa), aunque aún esta por debajo de la encontrada en Marte. Pero, lo interesante de este estudio fue que, una vez se obtenían células vegetativas de estas dos especies y se ponían en medios de cultivo y condiciones análogas al encontrado en Marte (temperaturas de 20°C de día y -50°C de noche, radiación UV de 200 a 280nm a 3.6 W m–2 por 8 horas, presiones de 0.71kPa y una proporción de gas similar a la composición de su atmósfera) pudieron sobrevivir aunque nunca pudieron incrementar su densidad celular. Así que hay que tener más cuidado para futuras investigaciones, y no emocionarnos mucho si encontramos pequeños microbios en Marte porque podría ser nuestras propias formas de vida que se mantendrán en un estado de latencia hasta que las condiciones marcianas mejoren. Referencia: Berry, B., Jenkins, D., & Schuerger, A. (2010). Effects of Simulated Mars Conditions on the Survival and Growth of Escherichia coli and Serratia liquefaciens Applied and Environmental Microbiology, 76 (8), 2377-2386 DOI: 10.1128/AEM.02147-09 BioUnalm

... Read more »

  • January 9, 2011
  • 04:59 PM
  • 724 views

¿Por qué las plantas florecen en primavera?

by David Castro in BioUnalm

Antes de empezar definiré qué es la vernalización. Para esto quiero que se pregunten ¿por qué la gran mayoría de plantas florecen en primavera más que en otras estaciones? Tal vez  muchos se han hecho esta pregunta cuando eran niños, tal vez otros se la sigan haciendo pero les da vergüenza preguntar. La respuesta es que las plantas, al ser sometidas a un prolongado periodo a bajas temperaturas, adquieren una competencia para producir flores, a este fenómeno se le llama vernalización. Tal vez este fenómeno no es apreciable en nuestro país y en otros países ubicados cerca al ecuador, ya que por nuestra latitud, las temperaturas no pasan de 35°C en el verano a -20°C en el invierno como en Europa o EEUU. En el Perú, generalmente van de 35°C a 22°C en la selva, de 25°C a 5°C en la sierra y de 30°C a 10°C en la costa, dependiendo si es verano o invierno, respectivamente. Además, como la duración del día y la noche tanto en verano como en invierno no se desvían más de 1 hora (11 – 13 horas), nuestra temperatura promedio por día es bastante agradable. La vernalización es ampliamente aprovechada por los horticultores, para inducir la floración de sus plantas ornamentales en cualquier momento del año, siempre y cuando tengan un vivero con la temperatura y la iluminación controlada. Los horticultores ponen a sus plantitas en ambientes fríos por unas cuantas semanas y luego las regresan al ambiente con una temperatura agradable, al cabo de unos días empiezan a florecer. En otras palabras, someten a las plantas a un invierno artificial. Es por esta razón, que en la naturaleza, las plantas florecen en primavera, justo después del invierno, para así garantizar su éxito reproductivo. Sin embargo, se desconoce las bases bioquímicas y moleculares de este fenómeno. Además, tampoco se entiende por qué se da este fenómeno sólo en el invierno y no en el otoño, donde las temperaturas también son bajas la mayoría de los días. Fue así que Jae Bok Heo y Sibum Sung, ambos investigadores de la Universidad de Texas estudiaron a profundidad cómo se da este mecanismo en la planta modelo Arabidopsis thaliana. En A. thaliana la vernalización está controlado por el locus FLC (FLOWERING LOCUS C), quien es un potente represor de la floración. Durante el invierno, la cantidad de ARN mensajero (ARNm) de FLC disminuye progresivamente. La expresión de FLC baja debido a cambios en la estructura de la cromatina. Los cambios en la cromatina están controlados por un grupo de proteínas llamadas Polycomb como la PRC2. Por si no lo recuerdan, el ADN al ser tan largo que no cabría dentro de la célula, necesita empaquetarse y compactarse. Este empaquetamiento se da gracias a la acción de unas proteínas llamadas Histonas, que sirven como sostén para que el ADN se enrolle sobre él. De esta manera se forman los cromosomas. Pero, cuando el ADN está empaquetado no puede ser transcrito y los genes no serán expresados. Pero, un reciente descubrimiento muestra que el locus FLC al ser expresado de manera inversa, genera un ARN antisentido que boquea al ARNm de FLC. Este ARN antisentido se llama COOLAIR, el cual reprime a FLC durante la primera fase de la vernalización. Entonces, para que no se pierdan, haremos un recuento cronológico. Una vez que las flores fueron fecundadas, las altas temperaturas del verano y las temperaturas templadas del otoño mantienen activa la expresión del locus FLC, reprimiendo la floración de las plantas durante estas estaciones. Cuando llega el invierno, el constante frío hace que los niveles de FLC empiecen a caer, gracias a la acción de PCR2 que modifica la cromatina y el aumento en la expresión del ARN antisentido COOLAIR que bloquea al ARNm de FLC. Sin embargo, hasta ahora no se sabía como PCR2 se unía a la cromatina para modificarla. Así que Heo & Sung identificaron otro ARN no codificante que se expresa una vez que COOLAIR alcanza su pico máximo de expresión. A este ARN le pusieron el nombre de COLDAIR (COLD ASSISTED INTRONIC NO CODING RNA). El promotor de este ARN no codificante se encuentra en el primer intrón del locus FLC (ver Figura). Recordemos que en eucariotas, los genes están conformados tanto por intrones y exones. Cuando se transcribe un gen a partir de ADN se forma un pre-ARNm, el cual posee tanto los intrones como los exones, sin embargo, los intrones no llegan a traducirse en proteínas y por lo tanto son eliminados en un proceso conocido como splicing. De esta manera el pre-ARNm pasa a ser un ARNm, compuesto de puros exones. La inducción de la expresión de COLDAIR sólo depende del frío, mas no de otros factores de transcripción codificados en el genoma de la planta, así que se acción es independiente. Pero, ¿por qué COLDAIR no se expresa en otoño cuando hay algunos días fríos? La clave es que COOLAIR modifica la cromatina de tal manera que COLDAIR pueda expresarse. Y como vimos anteriormente, la cantidad de COOLAIR aumenta gradualmente a medida que la planta está siendo sometida al frío. Cuando COOLAIR alcanza un pico máximo de expresión recién en ese momento se expresa COLDAIR y la cantidad de ARNm de FLC cae considerablemente. A este pico máximo se le llama umbral. Esta es la explicación de por qué se requiere de una prolongada exposición al frío continuo para que la planta experimente la vernalización. Para que los niveles de COOLAIR logren acumularse hasta alcanzar el pico máximo. Ahora, ¿para qué sirve COLDAIR? Ya vimos que PCR2 es necesario para la modificación de la cromatina y la posterior represión de FLC. Sin embargo, PCR2 está unida a una región del locus FLC que no afecta su transcripción, así que PCR2 debe ser movido hacia un punto donde si afecte la expresión de FLC. COLDAIR se encarga de este trabajo manteniéndose el tiempo suficiente como para que PCR2 sea capturado y realice su trabajo de modificar la cromatina. Una vez PCR2 se ubica en el locus FLC, modifica las histonas H3 mediante metilaciones, formando una estructura más estable y empieza a unirse a más PCR2 gracias a la acción de proteínas accesorias como la VIN3 y la VIL1. En este punto ya no se requiere de la presencia de COLDAIR y termina por desaparecer. Así que para el final de la vernalización ya no hay ni FLC, ni COOLAIR ni COLDAIR y la planta empieza a formar las flores, coincidiendo justo con el inicio de la primavera. Aquí les pongo un diagrama que resume todo el proceso: Las plantas están muy adaptadas a su ambiente. Su sistema de represión de FLC está sincronizado con la duración del invierno según la región donde habitan. Es por esta razón que hay muchas plantas ornamentales que nunca producirán sus bellas flores si no se encuentran en su ambiente natural. Hacer una vernalización artificial es la mejor solución. Esto también explica por qué el calentamiento global afecta el comportamiento de las plantas, ya que se ha observado que algunas plantas han adelantado sus periodos de floración durante los últimos años. Esto puede perjudicarlas enormemente ya que los insectos que las polinizan y las aves que transportan sus semillas pierden la sincronización, y hay una considerable pérdida en la biodiversidad. Aún falta determinar cómo hace el frío para inducir la expresión de COOLAIR y COLDAIR, y como FLC vuelve a su estado activo una vez que las temperaturas aumentan. Una posible explicación es que... Read more »

  • May 24, 2010
  • 02:59 AM
  • 723 views

S. aureus vs S. epidermidis

by David Castro in BioUnalm

Día a día luchamos contra pequeños organismos capaces de causarnos serias enfermedades e infecciones, pero también vivimos en armonía con millones de bacterias que en vez de hacernos daño nos favorecen, tal como las bacterias que viven en nuestro sistema digestivo. Sin embargo, también tenemos bacterias que habitan normalmente nuestra piel, sin causarnos daño alguno, pero que si llegan a entrar a nuestro organismo pueden causarnos terribles males como la neumonía, meningitis, endocarditis y septicemia. Estamos hablando del Staphylococus aureus. El S. aureus es un habitante común de las fosas nasales, más de la tercera parte del mundo la tiene colonizando sus narices, pero hay una con la que debemos tener cierto cuidado, la S. aureus resistente a la meticilina (SARM). Sin embargo, la mayoría de las personas podemos combatir a esta bacteria, pero puede llegar a ser mortal si infecta a pacientes con el sistema inmunológico comprometido como son los infectados con el VIH o los que están recibiendo tratamiento para alguna enfermedad autoinmune. Los esfuerzos por diseñar nuevos compuestos capaces de inhibir el crecimiento de SARM son grandes, pero hasta ahora no se han obtenido buenos resultados. Por suerte, S. aureus no es el único comensal que vive en nuestras narices, también lo hace su primo hermano, el S. epidermidis, que es más común que el S. aureus y es el principal contaminante de todos nuestros equipos de laboratorio. Al igual que su primo hermano, S. epidermidis es inofensivo menos en las personas con el sistema inmune comprometido. Pero lo que Iwase et al. encontraron fue muy interesante… S. epidermidis inhibía el desarrollo de S. aureus. Iwase y sus colaboradores revisaron las narices de 88 voluntarios. Virtualmente, todo ellos estaban colonizados por S. epidermidis, pero S. aureus pudieron “establecer sus carpas” en la tercera parte de los voluntarios. Normalmente, S. aureus y S. epidermidis son capaces de coexistir en armonía, pero los investigadores encontraron algunas cepas de S. epidermidis eran los némesis de S. aureus. Las colonias de S. aureus forman estructuras morfológicas con características funcionales complejas llamadas biopelículas (biofilms), las cuales son una extensión de la matriz extracelular de las bacterias rica en polisacáridos, que les da protección haciéndolas difícil de matar. Muchas de las bacterias patógenas que hoy conocemos forman biopelículas, convirtiéndolas en un importante reto para la salud pública. S. epidermidis no solo previene la formación de biopelículas por parte de S. aureus, también puede destruir las existentes. Las personas que tienen S. epidermidis en sus narices, tienen un 70% menos de probabilidad de ser colonizados por S. aureus. Iwase aisló estas cepas de S. epidermidis y las cultivó junto a S. aureus para extraer y purificar el compuesto que le daba esta propiedad asesina. Las secreciones eran ricas en una proteína a la cual llamaron Esp (serina proteasa de S. epidermidis). Como era de esperarse, esta proteína estaba ausente en aquellas cepas que no inhibían el crecimiento de S. aureus y si se removía el gen que la codificaba, la S. epidermidis perdía su capacidad inhibidora. Barras Negra: efecto de S. epidermidis competente. Barras blancas: efecto de S. epidermidis no-inhibitoria Pero la Esp no actúa por sí sola, lo hace en conjunto con una proteína defensiva humada llamada hBD2 (β-defensina Humana 2) que es secretada por nuestras células de la piel. De por sí sola, la hBD2 puede matar al S. aureus, pero no lo suficiente como para evitar que formen las biopelículas. Sin embargo, Esp no tenía la capacidad de hacerlo por sí misma. Pero una vez juntas, su efecto era sumamente efectivo, aún así S. aureus ya esté protegida por sus biopelículas. No se sabe si estas dos proteínas coevolucionaron quedando la puerta abierta para futuras investigaciones. Como experimento final, insertaron S. epidermidis competentes en pacientes con las fosas nasales colonizadas por el S. aureus y observaron que la bacteria trasplantada eliminó a todos sus primos hermanos. También se introdujo una pequeña dosis de la proteína Esp purificada y se obtuvieron los mismos resultados. Este descubrimiento da el primer paso al desarrollo de compuestos capaces de combatir a la temible SARM que permitirían mejorar la calidad de vida de los pacientes que sufren de VIH o de enfermedades autoinmunes. Otra pregunta queda abierta… ¿Por qué S. aureus no ha desarrollado algún tipo de resistencia a la Esp? Referencia: Iwase, T., Uehara, Y., Shinji, H., Tajima, A., Seo, H., Takada, K., Agata, T., & Mizunoe, Y. (2010). Staphylococcus epidermidis Esp inhibits Staphylococcus aureus biofilm formation and nasal colonization Nature, 465 (7296), 346-349 DOI: 10.1038/nature09074 BioUnalm

... Read more »

  • March 26, 2010
  • 04:38 AM
  • 721 views

Una nueva estrategia para producir plantas haploides

by David Castro in BioUnalm

Producir plantas haploides viables es uno de los santos griales del fitomejoramiento y la biotecnología vegetal. ¿Por qué? Porque lo que un fitomejorador quiere es que una vez que consiga una planta con un alto rendimiento, que resista enfermedades o sequías o que no tenga muchos requerimientos nutricionales, esta siga una línea homocigota. Esto quiere decir que sólo tenga un determinado alelo para cada gen, de esta manera, al auto-fertilizarla o cruzarla con otra planta similar, estas características adquiridas no se pierdan. De manera más sencilla: Recordemos que una mitad de los genes son de la madre y la otra mitad del padre. Digamos que los genes de la madre  le dan un buen rendimiento a la planta pero no soportan las sequías (AAbb), mientras que los genes del padre no tienen buen rendimiento pero soportan muy bien las sequías (aaBB). Lo que buscaremos es cruzar estas dos plantas para obtener una planta con alto rendimiento y que soporte la sequías (AAbbXaaBB). Así que después de algunos meses por fin obtenemos la planta deseada (AaBb). Pero, como la planta tiene la mitad de los genes del padre y la otra mitad de la madre, será heterocigota (tiene los genes buenos y también los genes malos, pero los como buenos son dominantes, se expresan) así que al auto-fertilizarla (AaBbXAaBb) sólo un 25% de las plantas tendrán solo los genes buenos (AABB).   Entonces, lo ideal sería hacer que la planta se quede con un sólo juego de genes (los buenos) y eliminar los malos (ab) para recién auto-fertilizarla. Para esto debemos reducir su carga genética a la mitad, volverlas haploides (AB). Pero las plantas necesitan de los dos juegos (diploides) para poder vivir, así que debemos diseñar un método para producir plantas haploides viables, que posteriormente se puedan volver nuevamente diploides (AABB), se puedan cruzar o auto-fertilizar (AABBXAABB) para generar semillas viables homocigotas (AABB). ¿Se ve sencillo no? Pero no es así. Estas características no están gobernadas solo por dos genes (AB) con dos alelos (A, a, B, b), son muchos los genes y alelos que gobiernan estas características (A1, A2, A3,…B1, B2, B3,… C1, C2, C3,… D1… E… F…), así que obtener la planta deseada se hace demasiado tedioso, con muchos años de cruzas, retrocruzas y auto-fertilizaciones. Así que, porque no desarrollar una técnica que primero parta en la mitad los genes (AaB1B2CcDdEEF1F3 [diploide] –> AB2CDEF3 y aB1cdEF1 [haploides]) para luego regenerar la diploidía (AAB2B2CCDDEEF3F3 y aaB1B1ccddEEF1F1), todos homocigotas. ¿Cuanto tiempo ahorraría esto? Por suerte hasta ahora habían dos métodos —no muy buenos— usados para volver haploides a las plantas. El primero era cultivar gametofitos (células sexuales, haploides) en medios de cultivo especiales para regenerar plantas diploides homocigotas; lamentablemente, muchas especies son recalcitrantes a este proceso. La segunda opción era hacer cruces inter-específicos (cruzar una especie con otra diferente) en el cual el genoma de uno de los parentales es eliminado; pero la base molecular de este proceso de eliminación genómica aún no se entiende. No olvidemos que hay un proceso natural para generar células haploides: la meiosis. Si nos ponemos a pensar un rato en la división celular, tanto en la mitosis como en la meiosis las cromosomas migran a través del huso acromático. Estos microtúbulos se unen a un lugar específico de los cromosomas para jalarlos a un determinado polo para formar el material genético de cada una de las células hijas, esta zona es conocida como el centrómero. Los centrómeros son reconocidos específicamente por un tipo de histona, la CENH3 en Arabidopsis thaliana (una variable de la histona tipo H3), la cual es necesaria para una buena migración de los cromosomas por el huso acromático. El mutante cenh3-1 fue aislado. Este mutante provoca la muerte del embrión, pero si está presente un CEHN3 sano complementario (dominante), la planta expresa un fenotipo silvestre (normal). Entonces, este mutante debe tener algún efecto en la migración de los cromosomas para causar la muerte del embrión, por qué no aprovecharlo de alguna manera para generar plantas haploides. Se diseñó una planta GFP-tailswap, una planta con el gen mutante cenh3-1 rescatado por una CENH3 modificada unida a la proteína verde fluorescente (proteína que brilla de color verde bajo las luz UV) para ubicar la histona. Esta planta no tiene problemas al realizar la mitosis pero son estériles al llegar la floración. Esto quiere decir que se ha visto afectada la producción de los gametos, en otras palabras, ha fallado algo en la meiosis. Cuando la planta GFP-tailswap es polinizada por una planta silvestre, entre el 80 y el 95% de los óvulos fertilizados son abortados. Se esperaba que la descendencia viable fueran heterocigotas para cenh3-1 y hemicigota para GFP-tailswap, pero 10 de las 16 plantas viables solo tenían el gen CERH3 y no el GFP-tailswap. Pero, a pesar que tenían el genotipo silvestre eran estériles. ¿Por qué? Un estudio posterior reveló que eran haploides! Si no se han perdido… que quiere decir esto? Sólo permaneció el genoma del parental silvestre mientras que el genoma del parental GFP-tailswap se perdió. Por fin se pudo crear una planta haploide, y sólo del parental silvestre. Si en vez de ese parental silvestre usamos una parental con genes excelentes, podremos obtener un haploide sólo con los genes excelentes, justo lo que estamos buscando! La explicación de esto es que hay una perturbación en la estructura del centrómero que impide la segregación de los cromosomas en la mitosis zigótica creando un embrión haploide. Al analizar el ADN plastídico se observó que el citoplasma siempre era materno. Por esta razón cuando se cruza un tipo silvestre como madre y un GFP-tailswap como padre, la proporción de haploides es menor a que si fuera al revés. Esto porque el CERH3 presente en la madre, se expresa más tempranamente que el mutante del padre, uniéndose a los cromosomas antes que el mutante, generando diploides. Si es el mutante la madre, expresará primero el gen mutante cenh3-1 y se unirá a los cromosomas antes que el CERH3, evitando la segregación de los cromosomas, generando haploides. Los diploides y los haploides son morfológicamente similares, simplemente los haploides son ligeramente más pequeños. Pero para explotar el potencial de los haploides, hay que generar diploides fértiles. Una pequeña minoría de los haploides, todos los cromosomas segregan a una de las células hijas en la Anafase I y luego las cromátides hermanas se separan en la meiosis II, generando gametos haploides (tétradas haploides). Estos pueden auto-fertilizarse generando diploides homocigóticos. También se han observado raros episodios, donde las células somáticas (tallos) se vuelven diploides espontáneamente. También se puede hacer el uso de la colchicina para regenerar los diploides. Muchos cultivos comerciales son poliploides, esto dificulta más aún los programas de fitomejoramiento. También se ha probado esta técnica para reducir la ploidía de estas especies. Para ir más allá de este descubrimiento, no sólo se podría usar al mutante cenh3-1 para generar haploides, también se podría usar ARN de interferencia para silenciar (reducir o eliminar) la función endógena del CERH3. En el maíz se ha podido inducir la haploidía usando al gen indeterminate gametophyte (ig), lamentablemente su ortólogo en A. thaliana no pudo copiar este efecto. Pero esta técnica del mutante cenh3-1 fácilmente se podría extrapolar a otras especies, además presenta muchas ventajas como: no requiere de medios de cultivo sofisticados, se puede producir tanto haploides ... Read more »

  • April 24, 2012
  • 10:17 AM
  • 720 views

¿Cuál es la mejor plataforma de secuenciamiento?

by David Castro in BioUnalm




Estudio compara la rapidez, precisión y eficiencia de las tres principales plataformas de secuenciamiento de ADN.





La tecnología ha avanzado tan rápido que hemos llegado a un punto en el que los secuenciadores de ADN no son más grandes que una simple impresora multifuncional. Parece ayer cuando la secuencia del genoma humano fue presentado al mundo, más de una década después de haberse iniciado el proyecto. Ahora, lo podríamos hacer en unas pocas semanas con un presupuesto cien mil veces inferior al original.



Un grupo de investigadores ingleses, liderados por el Dr. Mark Pallen de la Universidad de Birmingham, han comparado las tres plataformas de secuenciamiento de alto rendimiento (el famoso ‘high-throughput’) más populares del mercado: Ion Torrent Personal Genoma Machine (PGM) de Life Technologies, MiSeq Personal Sequencer de Illumina y 454 GS Junior de Roche; en función a su rapidez, precisión y eficiencia. La prueba fue secuenciar el genoma de la E. coli O104:H4, bacteria responsable del brote del síndrome urémico hemolítico ocurrido en Alemania el año pasado. Los resultados fueron publicados el 22 de abril de Nature Biotechnology.



Características generales



El 454 GS Junior salió al mercado a inicios del 2010, siendo la evolución del famoso 454 GS FLX. Lo que hace es básicamente romper el ADN en pequeños fragmentos, para luego capturarlos en esferas microscópicas y empezar a copiarlos, añadiendo nucleótido por nucleótido. Cada vez que un nucleótido se une al fragmento original que sirve de molde, emite una luz que es recibida y transformada en una señal digital por una cámara especial. La computadora lee esta señal y la transforma en una secuencia de letras. Este proceso lo hace miles de veces simultáneamente, y es así como puede obtener la secuencia completa de un pequeño genoma, por ejemplo, de una bacteria, en unas pocas horas.











El Ion Torrent PGM ya lo vimos en detalle en un post anterior [Véase “Secuenciamiento en chips”]. Resumiendo, lo que hace este equipo es algo similar al procedimiento del 454 GS Junior, pero que en vez de usar luminiscencia y detectores de luz, usa sensores de voltaje capaces de detectar los Hidrógenos (H+) liberados cada vez que un nucleótido se une a la nueva cadena en formación. En otras palabras, la señal es el cambio de pH ínfimo en la solución de reacción. El proceso se lleva a cabo en chips con más de once millones de pocillos, lo que permite tener la secuencia completa del genoma de una bacteria en un sólo proceso.











Por otro lado, el MiSeq salió al mercado hace menos de un año y es la evolución del Solexa. Este secuenciador funciona de manera parecida al 454 GS Junior, pero no usa microesfereas para llevar a cabo la reacción de síntesis del fragmento de ADN molde, sino una lámina cubierta por secuencias específicas. Los nucleótidos son detectados uno a uno mediante la luminiscencia que emiten a medida que se van uniendo a la cadena en formación.









Precios y eficiencia


[Los precios son referenciales varían de acuerdo a la región geográfica]


El 454 GS Junior tiene un precio de $108.000. Cada proceso genera 35 millones de bases de información (Mb) con un costo de $1100 y en un tiempo de ocho horas.


El Ion Torrent PGM cuesta $80.490. Cada proceso genera entre 10 Mb y 1000 Mb de información —dependiendo del chip usado— con un costo de $225 a $625 y en un tiempo de tres horas.


Por su ... Read more »

Loman, N., Misra, R., Dallman, T., Constantinidou, C., Gharbia, S., Wain, J., & Pallen, M. (2012) Performance comparison of benchtop high-throughput sequencing platforms. Nature Biotechnology. DOI: 10.1038/nbt.2198  

  • October 10, 2010
  • 07:49 PM
  • 718 views

El maíz transgénico beneficia más a los que cultivan maíz no transgénico

by David Castro in BioUnalm

Para los que han leído mis artículos sobre transgénicos se habrán dado cuenta que yo no soy un partidario del ingreso de estos cultivos al Perú por las razones que he expresado anteriormente. Pero, estar en contra al ingreso de transgénicos no es lo mismo que estar en contra de la biotecnología moderna, tal como algunos de nuestros brillantes científicos lo pretenden pintar. Con una buena regulación, donde los desarrolladores de cultivos transgénicos asuman sus responsabilidades por algún efecto negativo sobre la biodiversidad, y orientar el desarrollo de cultivares genéticamente modificados para que estos puedan crecer con bajas cantidades de agua o soportar climas fríos para que así se puedan aprovechar terrenos no usados en la agricultura sería muy beneficioso para nuestro país. No necesitamos depender de semillas vendidas por empresas extranjeras, nosotros tenemos la tecnología para desarrollar nuestros propios transgénicos, tal como lo viene haciendo el Centro Internacional de la Papa (CIP), sólo con un poco más de inversión por parte del estado y mayor seriedad en la elaboración de la normativa regulatoria, dejando de lado los intereses personales, el Perú podría aprovechar de manera óptima sus recursos genéticos. Además, creo que los medios de  comunicación no son objetivos cuando hablan sobre el tema. Según su posición y sus intereses personales o bien muestran a los transgénicos como los causantes de alergias, tumores, suicidios masivos y a los que apoyan los transgénicos  los pintan de lobbystas y vendepatrias; o bien muestran a los transgénicos como los que salvarán al mundo del hambre, volverá ricos a los agricultores y a los opositores de los transgénicos los pintan de ignorantes o activistas. Es triste ver como reconocidos científicos llegan hasta los insultos por defender imponer sus ideas, tal como en una lucha entre ateos y cristianos o creacionistas y evolucionistas. En fin, dejando de lado esta pequeña opinión, les comentaré un interesante artículo publicado por Hutchison et al. el día viernes en Science, donde analiza datos de áreas de cultivo de maíz transgénico (especialmente el Maiz Bt), reducción de población de plagas (Ostrinia nubilalis, una plaga del maíz), y beneficios económicos de los agricultores del centro de los Estados Unidos antes y después de la introducción de cultivos de maíz Bt en el año 1996. Primero algunos números para que vean la importancia de los cultivos transgénicos en la agricultura. Sólo el año pasado se han plantado 134 millones de hectáreas de cultivos transgénicos en 25 países del mundo. En USA el más abundante es el maíz transgénico, especialmente el Bt, el cual tiene insertado un gen de una bacteria (Bacillus thuringiensis) que codifica para una toxina que se expresa en las hojas de la planta y mata a las orugas de muchas lepidópteras, incluido el piral del maíz (Ostrinia nubilalis), una polilla europea que fue introducida por casualidad en USA en 1917. Las pérdidas por esta plaga – antes del maíz Bt – ascendían a $1000 millones/año. Si bien la toxina Bt puede matar a los insectos que atacan el cultivo, no sería nada raro que aparezcan insectos que sean resistentes a esta toxina. El maíz Bt ejerce una fuerte presión evolutiva sobre estos insectos, tal como los antibióticos lo hacen sobre las bacterias patógenas. Así que si aparece un insecto inmune a la toxina Bt, con un buen fitness (aptitud para dar descendencia fértil), los días de este maíz transgénico podrían estar contados y sería una grave amenaza para la agricultura mundial, ya que 25 países cultivan este maíz. Sin embargo, en los 14 años que lleva introducido el maíz Bt en el territorio norteamericano, los daños causados por el piral del maíz se ha reducido con respecto a los años donde no había maíz Bt (antes de 1996). La clave de este éxito del maíz Bt no ha sido sólo su resistencia a las plagas, sino la presencia de cultivares de maíz no transgénicos aledaños. ¿Cómo? Ahora les explico… Las polillas hembra no tiene preferencia al momento de poner sus huevecillos, lo hacen indistintamente en el maíz Bt o en el maíz NO-Bt. Entonces, si hay más cultivos de maíz Bt, más larvas de polillas morirán y la población de estas plagas se irá reduciendo con el tiempo.   Y por qué no cultivar puro maíz Bt para que eliminar por completo estas plagas? La idea de tener chacras de maíz NO-Bt aledaños a las chacras de maíz Bt es para que actúen como un refugio para los lepidópteros, de esta manera, la presión evolutiva que ejerce la toxina Bt se verá contrarrestada por un refugio natural de plagas sensibles al Bt.   Sí sólo hubiera maíz Bt, las plagas empezarían a morir y desaparecer, pero se correría el riesgo que una población adquiera resistencia a la toxina y se empiece a multiplicar y a diezmar con los cultivos de maíz transgénico. Pero, si tenemos un reservorio de plagas sensibles al Bt, la presión evolutiva que ejercería la toxina se vería reducida, porque las poblaciones de plagas se distribuirán indistintamente entre los cultivos de maíz Bt y NO-Bt. Menos población de plagas en las plantas transgénicas, menos probabilidades de que surja un mutante resistente y una fuente de retroalimentación de plagas sensibles al Bt. Es por esta razón que la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) exige a los agricultores que usan maíz Bt, sembrar también refugios de maíz NO-Bt a no más de 800m de distancia, para promover la supervivencia de insectos susceptibles a la toxina. Aún así, los insectos pueden mutar y adquirir la resistencia al maíz Bt. Pero, las mutaciones son principalmente recesivas, así que estos híbridos seguirán siendo sensibles aunque en menor medida. Para evitar que lleguen a pasar su resistencia a sus descendientes, deben consumir una cantidad mayor de toxina Bt para que mueran, de no ser así se correría el riesgo de que aparezcan poblaciones resistentes. Para evitar esto, otra estrategia más que ha adoptado EPA es que los desarrolladores de semillas usen más de una toxina Bt que actúe sobre la misma plaga. De esta manera, si el insecto adquiere resistencia para una toxina Bt habrá otra que la matará. (…) Retomando el tema principal de este artículo (…) Hutchison et al. descubrieron que los mayores beneficios económicos entre 1996 y el 2009 estaban asociados a los agricultores que no sembraban maíz Bt ¿Como? . O sea, ¿beneficia más al que no usa la tecnología que al que la usa? Sí, y esto se debe al “efecto halo”. ¿En que consiste?… Como ya explicamos anteriormente, las lepidópteras hembra ponen sus huevos indistintamente en el maíz Bt y NO-Bt, si hay mayor proporción de maíz Bt, más poblaciones de insectos serán eliminados así que habrá menos insectos que infecten a los maíces no transgénicos. Ver figura: Así que, indirectamente, los que cultivan maíz NO-Bt se están librando de las plagas gracias al maíz Bt de los agricultores vecinos. En ciertos estados de USA como Minnesota, Illinois y Wisconsin, más del 50% del maíz es Bt, así que el efecto será mayor. Por ejemplo, en Minnesota, antes del ingreso del maíz Bt, el número de larvas era de 59 por cada 100 plantas. Cuando los campos de maíz Bt alcanzó el 40% del total del maíz cultivado, el número de larvas por cada 100 plantas se redujo en más del 70% (16 larvas por cada 100 plantas). Resultados similares se obtuvo en Illinois y Wisconsin. Aunque, si bien muchos factore... Read more »

Hutchison, W., Burkness, E., Mitchell, P., Moon, R., Leslie, T., Fleischer, S., Abrahamson, M., Hamilton, K., Steffey, K., Gray, M.... (2010) Areawide Suppression of European Corn Borer with Bt Maize Reaps Savings to Non-Bt Maize Growers. Science, 330(6001), 222-225. DOI: 10.1126/science.1190242  

Tabashnik, B. (2010) Communal Benefits of Transgenic Corn. Science, 330(6001), 189-190. DOI: 10.1126/science.1196864  

  • July 18, 2011
  • 03:20 PM
  • 718 views

La carencia de un gen convierte a un ratón en todo un maratonista

by David Castro in BioUnalm



¿Te imaginas algún día tomar un medicamento capaz de bloquear la acción de un gen y convertirte en todo un atleta capaz de completar la Maratón de Nueva York fácilmente?. Tal vez ese día está más cerca de lo que pensamos ya que un grupo de investigadores australianos y estadounidenses liderados por el Dr. Emidio Pistilli de la Universidad de Pensilvania demostraron que aquellos ratones que carecían del gen IL-15Rα mostraban una mayor capacidad atlética y resistencia a la fatiga según un artículo publicado hoy en The Journal of Clinical Investigation. El gen IL-15Rα codifica para un receptor de membrana que reconoce a la citoquina llamada IL-15. Tanto el receptor como su ligando se expresan en una gran variedad de tejidos, pero es en el tejido muscular esquelético donde dicha expresión es mayor, es por esta razón que tienen un rol importante en el fenotipo de los músculos y se los ha encontrado asociados con la resistencia muscular, síndromes metabólicos e incluso con la obesidad. Para determinar si este gen tiene algún efecto sobre la capacidad atlética de un organismo, Pistilli et al. desarrollaron ratones mutantes carentes del gen IL-15Rα. Los ratones, al igual que los humanos, poseen dos tipos de tejido muscular: los de contracción rápida, encargados de los movimientos más finos (Ej.: los músculos de los dedos) y los de contracción lenta, encargados de los movimientos más grandes (Ej.: los músculos de las piernas o la espalda). Los músculos de contracción rápida son menos resistentes a la fatiga, así que los investigadores primero se enfocaron en el músculo extensor largo de los dedos de los ratones carentes del gen IL-15Rα. Los investigadores observaron que en estos ratones mutantes había un reordenamiento del tejido muscular de contracción rápida el cual mostró un fenotipo más oxidativo y una mayor resistencia a la fatiga. Sin embargo, la resistencia no se debe a que el músculo de contracción rápida se convirtió en uno de contracción lenta, sino que el cambio se encontraba a nivel del número de mitocondrias y fibras musculares. Luego, Pistilli et al. quisieron ver que efectos tenía este cambio fenotípico en los músculos sobre la capacidad atlética del ratón. Para ello, los investigadores pusieron una rueda giratoria dentro de las jaulas de los ratones. Estas ruedas giratorias estaban acopladas a un dispositivo que contabilizaba el número de revoluciones que da, para así determinar la distancia recorrida por el ratón. Los resultados obtenidos fueron sorprendentes: los ratones que no tenían el gen IL-15Rα recorrían seis veces más distancia que los ratones normales (B6129). Si bien estos estudios han sido hechos en ratones, existen reportes de análisis genéticos de este mismo gen en humanos. Los datos han mostrado que ciertas mutaciones en estos genes (IL15 y IL-15Rα) están asociados con la respuesta del tejido muscular al entrenamiento físico. Por ejemplo, hay una mutación puntual en el exón 3 del gen IL-15Rα que se está presente en ciertos atletas de élite, principalmente en aquellos que requieren de gran resistencia a la fatiga. Estos resultados no indica que si queremos convertirnos en todos unos maratonistas basta con bloquear el gen IL-15Rα ya que éste se expresa no sólo en los músculos, sino en muchos otros más, y los efectos sobre la fisiología de nuestro organismo podrían ser perjudiciales. Por otro lado, los investigadores no entienden por qué los ratones mutantes tenían ese deseo de correr mayores distancias en sus ruedas giratorias —que tengan una mayor resistencia física no indica que los ratones corran voluntariamente por más tiempo. Sin embargo, entender a fondo la función de este gen podría ayudar a solucionar ciertos tipos de enfermedades metabólicas que aquejan a la humanidad. Referencia: Pistilli, E., Bogdanovich, S., Garton, F., Yang, N., Gulbin, J., Conner, J., Anderson, B., Quinn, L., North, K., Ahima, R., & Khurana, T. (2011). Loss of IL-15 receptor α alters the endurance, fatigability, and metabolic characteristics of mouse fast skeletal muscles Journal of Clinical Investigation DOI: 10.1172/JCI44945 BioUnalm... Read more »

Pistilli, E., Bogdanovich, S., Garton, F., Yang, N., Gulbin, J., Conner, J., Anderson, B., Quinn, L., North, K., Ahima, R.... (2011) Loss of IL-15 receptor α alters the endurance, fatigability, and metabolic characteristics of mouse fast skeletal muscles. Journal of Clinical Investigation. DOI: 10.1172/JCI44945  

  • August 10, 2010
  • 12:26 AM
  • 717 views

Las esponjas y la complejidad animal

by David Castro in BioUnalm

Las esponjas existen desde hace unos 635 millones de años, siendo los primeros organismos multicelulares (metazoos) en aparecer sobre la Tierra. Conocerlos a fondo nos daría muchas claves acerca de la evolución de todos los animales complejos que hoy conocemos, desde las medusas hasta el mismo hombre. Las esponjas no tienen una arquitectura corporal definida – como si lo tienen los Bilaterios –, tampoco presentan órganos, ni músculos y mucho menos sistema nervioso. Por estas razones, científicos de la Universidad de Berkeley, liderados por la Dra. Mansi Srivastava, secuenciaron el genoma de una esponja típica, la Amphimedon queenslandica, y presentaron el primer borrador en la revista Nature. El genoma es relativamente pequeño – en comparación con el de otros animales – ya que cuenta con sólo 167Mpb (millones de pares de base); sin embargo, su genoma es sumamente complejo. Al analizarlo se identificaron ~30000 posibles genes (el 97% de su genoma es codificante), de los cuales 18693 (~63%) tienen homólogos en otros organismos. Para tener una visión mas clara del genoma de la esponja la compararemos con el genoma humano. Nuestro genoma tiene unos 3200Mpb y ~27000 genes. Sólo el 1.5% de nuestro genoma es codificante. Si es un organismo primitivo, ¿de donde tiene tantos genes?. En primer lugar, esos casi 30000 genes son putativos, o sea, han sido predichos usando herramientas bioinformáticas los cuales ubican codones de iniciación y codones de terminación para generar los ORFs (marcos abiertos de lectura). Luego, esos ~30000 genes han sido comparados con genes de otras especies usando herramientas como BLAST y ~18693 encontraron algún gen homólogo o semejante en toda la base de datos (GenBank). Además, los genes de la esponja presentaron una marcada conservación estructural (disposición de los intrones y exones) y una organización genómica similar al de otros animales más complejos. Esta semejanza estructural sugiere que el último ancestro común entre las esponjas y las “animales verdaderos” o Eumetazoos, ha sido el punto de partida de la alta complejidad de los animales que hoy conocemos. Ver la siguiente figura para explicarles: Filogenia de los metazoos Antes de secuenciar el genoma de la esponja se creía que la complejidad de los animales empezó desde el último ancestro común entre los unicelulares (Monosiga) y los animales (Metazoos), en la transición del lila al rosado; en otras palabras, las esponjas evolucionaron como un grupo parafilético; sin embargo, Srivastava et al. encontró que el 28% de las sustituciones de aminoácidos que diferencian al hombre del último ancestro común con los unicelulares ocurrió más adelante, antes de la divergencia entre las esponjas y los verdaderos animales (eumetazoos), en la transición del rosado al celeste, y este periodo se calcula que duró unos 150-200 millones de años, denominándolo periodo “pre-metazoo”. Pero, ¿que implicancias tiene este descubrimiento?. En primer lugar, los genes se agrupan por familias, según sus semejanzas en secuencias conservadas y función que cumplen. Las familias de genes de todos los metazoos suman 4670, de las cuales 1286 (27%) se encontraron en el genoma de la esponja. Este 27% vendrían a ser las familias de genes específicos de los metazoos y la madre de todas las demás familias de genes de los Eumetazoos, quienes, mediante duplicación genética, divergieron y evolucionaron. Esta divergencia aumentó entre 2 y 34 veces el número de factores de transcripción (reguladores de la expresión de los genes) en los eumetazoos con respecto a las esponjas. En cuanto a las proteínas codificadas por estos genes, se encontraron 235 dominios específicos de proteínas de animales complejos y 769 combinaciones de ellos que evolucionaron y divergieron en los eumetazoos. Todo esto sugiere y confirma que las esponjas ya tenían las familias de genes y proteínas madre de donde divergieron y evolucionaron todas las familias que hoy conocemos, mediante procesos de duplicación genética. La divergencia entre las esponjas y los eumetazoos fue el inicio de la complejidad de todos los animales que hoy conocemos. Otro punto bastante interesante del artículo es la presencia de 705 proteínas kinasa en Amphimedon, el número más grande reportado hasta el momento en cualquier metazoo, el cual incluye al 70% de las clases de kinasas humanas y al menos a un representante de la mayoría de clases de kinasa de todos los metazoos. Y, ¿que tienen de bueno las kinasas?. Las proteínas kinasa son la clave de la multicelularidad de los metazoos. Participan en los 6 procesos más importantes del desarrollo celular: Regulan el crecimiento y ciclo celular. Si bien la p53 apareció desde los Holozoos, su capacidad para responder ante el daño de ADN apareció justo cuando divergieron los eumetazoos, así como las Ciclinas dependientes de Kinasa (CDK) que son conocidos, en la actualidad, como supresores de tumores. La regulación del crecimiento celular vía insulina también emergió a partir de los genes ancestros PDK1 y Akt kinasas. Regulan la muerte celular programada (Apoptosis). Las proteínas clave en este mecanismo son las Caspasas, las cuales interactúan con muchas kinasas. Amphimedon codifica para ciertos iniciadores y efectores de caspasas. Adhesión celular. La adhesión célula-célula y célula-matriz celular es la clave para el desarrollo y evolución de los tejidos, componentes importantes de todos los animales. Las proteínas clave son las Cadherinas, las cuales son activadas vía fosforilación por kinasas. Amphimedon posee determinados receptores de membrana que interactúan con la matriz celular en animales complejos como las Integrinas. Señalización celular y regulación genética. Muchas vías de señalización y factores de transcripción están presentes en Amphimedon, sin embargo al no tener mesodermo carece de dichos mecanismos de desarrollo que están muy evolucionados en los eumetazoos. Amphimedon también carece de la familia de genes Hox, envueltos en el desarrollo del sistema nervioso y la arquitectura corporal. Este es uno de los procesos en los cuales los eumetazoos, especialmente los bilaterios, han evolucionado enormemente. Aloreconocimiento e inmunidad innata. La transición de unicelular a pluricelular trajo consigo la evolución de mecanismos de defensa contra invasores patógenos. si bien los genes de inmunidad aparecieron muy temprano, en el desarrollo de los eucariotas (hongos, plantas y animales), actualmente, casi todos están restringidos a los animales. Amphimedon y otras esponjas codifican para ciertos proteoglicanos que actúan como factores de agregación, promoviendo la adhesión celular y el aloreconocimiento. Especialización de tipos celulares. Las esponjas ya poseen varios genes con dominios tipo lamininas, las cuales están envueltas en la arquitectura de sistemas sensoriales y en la formación de estructuras tipo tejidos, esto permite que las esponjas puedan responder a los cambios en su entorno. Sin embargo, aún no han desarrollado células nerviosas propiamente dichas, pero si tienen un sistema sensorial primitivo. Como podemos ver, muchas clases de factores de transcripción y proteínas envueltas procesos del desarrollo celular ya están presentes en las esponjas. Además, todos estos procesos están envueltos en el desarrollo de tumores y cánceres cuando mutan y funcionan mal. Entender como han ido evolucionando estos genes, a través de los años, tal vez nos permita conocer como se han originado ciertas enfermedades que hoy ... Read more »

Srivastava, M., Simakov, O., Chapman, J., Fahey, B., Gauthier, M., Mitros, T., Richards, G., Conaco, C., Dacre, M., Hellsten, U.... (2010) The Amphimedon queenslandica genome and the evolution of animal complexity. Nature, 466(7307), 720-726. DOI: 10.1038/nature09201  

  • March 16, 2013
  • 04:03 AM
  • 717 views

Diarrea, cerdos y cabras transgénicas

by David Castro in BioUnalm

- Jaimito, ¿qué es más rápido, el rayo o la luz?- La diarrea señorita.- ¡Qué! ¿De dónde sacas eso?- Es que anoche me desperté como un rayo, prendí la luz… y ya me había cagao’. Por lo general, una diarrea te da en el momento menos oportuno, ya sea en un día de playa, en una reunión importante de trabajo o en la casa de tu enamorada. Sin embargo, las diarreas causadas por infecciones gastrointestinales (IG) cobran la vida de más de un millón de niños cada año. Las IG son causadas principalmente por la famosa E. coli. Si bien esta bacteria forma parte de nuestra flora intestinal desde que tenemos 48 horas de edad, ciertas variantes pueden desencadenar graves infecciones. Estas E. coli malas se caracterizan por liberar toxinas que activan una respuesta inflamatoria, disgregar las células que revisten nuestra pared intestinal y alterar la regulación de los canales iónicos causando la afluencia de iones y agua al lumen del intestino provocando diarreas agudas. Como consecuencia, se producen graves deshidrataciones y se reduce la absorción de nutrientes causando serios cuadros de desnutrición que afectan el desarrollo del niño. Los seres humanos contamos con un antibiótico natural de amplio espectro muy efectivo llamado lisozima. La podemos encontrar en nuestras lágrimas y saliva protegiéndonos contra diversas infecciones gracias a su capacidad de romper las paredes celulares de las bacterias. Esta enzima también está presente en la clara de los huevos y desde 1998 es usada como un aditivo en la industria alimentaria. Entonces, ¿podríamos usar la lisozima para combatir las IG provocadas por bacterias como E. coli? La respuesta es sí. Es más, la leche materna es una buena fuente de lisozimas que contribuye al establecimiento de bacterias beneficiosas en los infantes. Sin embargo, la mayoría de niños consume leche de vaca o de cabra, las cuales tienen bajas concentraciones de lisozimas. Había que hacer algo. Ya desde 1987 los científicos estaban interesados en incorporar lisozimas humanas (hLZ) a la leche de consumo diario. Para ello tenían que introducir el gen de la hLZ en embriones de algún animal lechero. Las cabras fueron la mejor elección debido a su menor tiempo de desarrollo comparado con el de las vacas. Doce años después, obtuvieron la línea de cabras transgénicas Artemis. Estas cabras Artemis producen 270 mg de hLZ por cada litro de leche. Esto equivale al 68% de la lisozima presente en la leche materna. La pregunta que queda es si esta leche será efectiva para el tratamiento de las IG en niños. Como no se puede experimentar la eficacia de esta leche directamente en niños humanos con IG sin antes demostrar que este producto derivado de un animal transgénico es inocuo, investigadores de la Universidad de California Davis infectaron 12 cerditos* con una cepa de E. coli patogénica llamada O149:F4+ (ETEC) para provocarles una IG y luego les dieron 250 ml de leche pasteurizada y enriquecida con hLZ tres veces a día como tratamiento. *Los cerdos y los humanos presentan una respuesta fisiológica similar ante una IG. Los cerditos que recibieron la leche enriquecida con hLZ se recuperaron mucho más rápido que los cerditos del grupo control, además mostraron menor grado de deshidratación y daño intestinal. Los leucocitos en sangre regresaron a sus niveles normales rápidamente y la expresión de citoquininas IL-8 (proinflamatorias) fue menor comparado con el grupo control. Estas pruebas demostraron que la alimentación con leche de cabra enriquecida con hLZ en el inicio de una infección intestinal causada por E. coli podría ser un tratamiento rápido y eficaz, al menos en cerditos. La enzima mata a las bacterias mientras que la leche rehidrata y recompone los iones perdidos. Como la lisozima presente en la leche de esta cabra transgénica es de origen humano, en teoría no causaría reacciones alérgicas en los niños que la consuman, tal como la insulina humana producida por bacterias no afecta a los diabéticos que se la administran. Referencia: Cooper, C., Garas Klobas, L., Maga, E., & Murray, J. (2013). Consuming Transgenic Goats' Milk Containing the Antimicrobial Protein Lysozyme Helps Resolve Diarrhea in Young Pigs PLoS ONE, 8 (3) DOI: 10.1371/journal.pone.0058409 BioUnalm



... Read more »

  • December 6, 2010
  • 01:09 PM
  • 711 views

Nueva técnica de visualización microscópica

by David Castro in BioUnalm

La microscopía es una de las herramientas más importantes de la biología celular y molecular, ya que nos ha permitido revelar las estructuras y formas subcelulares, como el núcleo, las mitocondrias y las membranas citoplasmáticas. Durante los últimos años, la microscopía ha avanzado mucho, permitiéndonos no sólo observar imágenes estáticas, sino también, ver estructuras complejas en pleno movimiento, y así entender mejor la dinámica celular. La microscopía electrónica (ME) nos ha permitido ver estructuras tan pequeñas como los virus. La ME de barrido, nos ha permitido ver de manera nítida y con gran resolución la superficie de células, bacterias, membranas, dándonos una imagen tridimensional de las mismas. Sin embargo, uno de los más grandes avances en la microscopía fue el desarrollo de la criomicroscopía electrónica (cryo-EM), la cual – usando temperaturas extremadamente bajas – permiten ver, de manera directa, la forma de pequeñas estructuras como los ribosomas y hasta ciertas proteínas y enzimas. A partir de esta técnica se desarrolló la tomografía crioelectrónica, que toma imágenes de la muestra, desde  distintos ángulos, para resolver la estructura tridimensional final. Esto combinado con la cristalografía de rayos X han sido muy útiles para el desarrollo de la biología estructural. Imagen ©MIT Sin embargo, para usar estas técnicas se debe purificar la estructura que queremos observar, y las imágenes son estáticas, no podemos usar la ME in vivo. Fue así que se desarrollaron técnicas de marcación de moléculas con tintes, y posteriormente, con moléculas fluorescentes. Usando estas técnicas se pudo, por ejemplo, determinar la dinámica de la división celular, marcando con una molécula fluorescente el ADN y con otro los microtúbulos, y ver en vivo y en directo, como es su dinámica durante cada una de las fases de la división celular. Imagen ©2009 Biochemical Society. Xu, T; et al. doi: 10.1042/BJ20082020 Pero, muchos de los tintes y moléculas fluorescentes son tóxicas para los organismos vivos, además, pueden perturbar el funcionamiento mismo de las células, o sea, no es lo mismo la migración de los cromosomas en la anafase con una molécula accesoria (la fluorescente) que sin ella. Así que, en los últimos años, empezaron a desarrollarse las imágenes de resonancia magnética  (MRI) a nivel celular, las cuales se caracterizaban por una gran penetración en las estructuras celulares pero carecían de una buena resolución. Fue así que aparecieron otras técnicas de imagen ópticas complementarias a las MRI, las cuales tenían un mayor poder de resolución espacio-temporal. Estas nuevas técnicas de imágenes ópticas se valen de la frecuencia de las vibraciones de los enlaces  de las distintas especies químicas (grupos funcionales) que conforman una determinada biomolécula. Unas de ellas se basa en la espectroscopía Raman, la cual mide la dispersión de un fotón que choca contra un determinado enlace químico. Cada tipo de enlace desviará el fotón de diferente manera. De esta manera se obtendrán imágenes a partir de las vibraciones. Cada biomolécula tiene enlaces diferentes, y podemos usar estas técnicas para diferenciar una especie química de otra y así observar sólo un tipo de biomolécula. La primera técnica basada en este principio fue CARS (Dispersión Raman Coherente Anti-Stokes), la cual usa tres rayos con diferentes frecuencias, las cuales interactúan con la muestra generando una señal óptica coherente que permite visualizar estructuras biológicas, sin embargo presenta algunos inconvenientes: sufre de una distorsión espectral que no permite diferenciar fácilmente las vibraciones de la muestra de la del fondo, limitando su sensibilidad, y no tiene una dependencia linear con la concentración de las moléculas de la muestra.   Pero, Saar et al. de la Universidad de Harvard han desarrollado una técnica que permite superar las limitaciones que tiene CARS mediante el uso de la Dispersión Estimulada de Raman (SRS) que permite un mayor contraste vibracional entre la muestra y el fondo; además, ha permitido capturar las imágenes de manera mucho más rápida, pero no lo suficiente como para usarlo en animales y humanos, ya que no generar distorsiones deberíamos permanecer estáticos por los menos un minuto, y a nivel microscópico es imposible. La velocidad de captura es de unos 25 cuadros por segundo a una resolución de 525x525 pixeles, lo cual permite hacer videos del movimiento de las moléculas en vivo. Aquí algunas imágenes obtenidas con esta técnica: A) Lípidos en la capa córnea, donde se muestran los corneocitos hexagonales. B) Moléculas de agua en la misma región usando SRS. C) Moléculas de agua en la misma región usando CARS, se puede apreciar la interferencia con los lípidos mostrados en A. D) Lípidos en la epidermis de las glándulas sebáceas. E) Moléculas de agua en la misma región. F) La misma región pero usando la vibración del CH3 para apreciar las proteínas y las estructuras residuales ricas en lípidos. Aquí les pongo el espectro Raman de varios compuestos químicos, para que lo puedan relacionar con la imagen anterior en base a la longitud de onda de las vibraciones de los enlaces químicos. Para descargar y ver los asombrosos videos tomados usando esta técnica visitar: http://bit.ly/gdXMXi Referencia: Saar, B., Freudiger, C., Reichman, J., Stanley, C., Holtom, G., & Xie, X. (2010). Vi... Read more »

Saar, B., Freudiger, C., Reichman, J., Stanley, C., Holtom, G., & Xie, X. (2010) Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science, 330(6009), 1368-1370. DOI: 10.1126/science.1197236  

  • November 11, 2010
  • 04:29 PM
  • 708 views

Obtención de metabolitos secundarios a partir de células madre vegetales

by David Castro in BioUnalm

Los productos naturales obtenidos de plantas han sido nuestra principal fuente de medicamentos, insecticidas, tintes, aromas y condimentos. Muchos de los compuestos que han salvado al mundo de enfermedades devastadoras como la malaria (quinina) o ciertos cánceres (vincristina, vinblastina, taxol), son derivados de las plantas. Pero, en los últimos años, las investigaciones en estos productos naturales han sido eclipsados por el desarrollo de técnicas como el tamizaje de alto rendimiento (high throughput screening), el cual se basa en probar – uno por uno – un catálogo de miles de moléculas contra diferentes agentes, ya sean microorganismos, virus, células cancerígenas u otros compuestos químicos. Sin embargo, hasta ahora no se ha podido igualar la eficiencia de los productos naturales de las plantas, ya que son sus complejas estructuras, difíciles de obtener mediante síntesis orgánica, las responsables de su actividad farmacológica. Pero, el principal problema es que, por ser metabolitos secundarios, su concentración en las plantas es muy baja y muchas veces se expresan sólo en condiciones especiales, lo cual reduce su rendimiento (cantidad de producto obtenido por planta) y se necesitan extraer más plantas para poder satisfacer la demanda del producto, esto trae consigo la reducción de su población y, posteriormente, su extinción. Muchos investigadores han desarrollado técnicas de cultivo in vitro de estas plantas, con medios especiales para promover la producción del metabolito secundario deseado, funcionando muy bien a pequeña escala, pero, cuando es llevado a un biorreactor de producción de gran escala, su rendimiento cae considerablemente y la viabilidad de los cultivos se pierde a medida que pasa el tiempo. Otra estrategia usada es identificar los genes responsables de la síntesis del metabolito secundario deseado, aislarlos e insertarlos en bacterias de fácil cultivo y crecimiento, mediante la ingeniería genética, para que sean las bacterias y no las plantas las encargadas de producir la molécula, o por lo menos un precursor a ella que luego es transformado en el compuesto deseado mediante síntesis orgánica. Sin embargo, la cantidad de enzimas involucradas en la síntesis del producto, así como los factores de transcripción que sólo se encuentran dentro de las células vegetales de donde fueron extraídos, hace que la bacteria sea incapaz de producir el metabolito secundario deseado. El Taxol®, es quizás la droga más usada en el tratamiento del cáncer. Este fármaco es derivado del paclitaxel, un metabolito secundario obtenido de la corteza del “tejo del pacífico” (Taxus brevifolia). Debido a la sobre-explotación de este árbol, grandes empresas farmacéuticas desarrollaron un método alternativo para producir paclitaxel usando biorreactores. La técnica consistía en cultivar células obtenidas de los embriones y pistilos de diferentes especies de Taxus. Estos medios de cultivo eran especiales porque permitían que estas células pasen a un estado de desdiferenciación (CDD) formando pequeños “callitos”. Luego, estas mezcla de células desdiferenciadas son puestas en biorreactores para producir el metabolito deseado. Sin embargo, este método de producción del paclitaxel tenía varias limitaciones incluyendo una baja tasa de crecimiento, agregación de las células (que dificultaban la producción a gran escala), bajos rendimientos y alta variabilidad en el producto obtenido. Un gran avance en este campo fue presentado por Lee et al. en la revista Nature Biotechnology. En vez de cultivar una mezcla de células desdiferenciadas, Lee usó células del cambium vascular, que forma parte del meristemo lateral de la planta (célula vegetal de constante crecimiento, capaces de diferenciarse en diferentes tejidos, o sea, similar a una célula madre) y las propagó en un medio de cultivo especial para inducir la formación de callos, tal como en el método anterior. ¿Cómo hizo Lee para extraer estas células? Primero extrajeron el cambium vascular con todas sus partes (indicados con flechas, en el mismo orden que la figura a): médula (amarillo), xilema (blanco), cambium (verde), floema (rojo), córtex (azul) y epidermis (turquesa). Luego, pelaron cuidadosamente y separaron la médula y el xilema de lo demás.  Luego, cultivaron el cambium, floema, córtex y epidermis en un medio especial para inducir la formación de los callitos. Después de unos días, se ve claramente la división entre las células desdiferenciadas (CDD) del floema, córtex y epidermis (Bottom) de las células indiferenciadas del cambium (Top). Separaron esos dos tipos celulares y se quedaron con las células meristemáticas del cambium (CMC). Las CMC fueron transferidas a un frasco con medio líquido y observaron que se desagregaron en pequeños grupos de células. Esto es una gran ventaja, porque si recordamos un poco, es la agregación de células la que provoca una caída en el rendimiento del producto en las CDD. Al medir el tamaño de los agregados celulares, en CMC el 95% medía menos de 0.5mm, mientras que en las CDD sólo el 5% eran de este tamaño. En cuanto al rendimiento de producción se encontraron grandes diferencias. Usando técnicas cuantitativas precisas (HPLC y LC-MS) determinaron que el rendimiento en frascos experimentales (125mL) fue tres veces superior usando las CMCs. Pero, como los lotes de producción son de varios litros, se debía estudiar el comportamiento de las células en mayores volúmenes, donde las fuerzas de cizalla o corte debido a la agitación, son bastante perjudiciales. En un pequeño biorreactor de 3 litros, las CMCs produjeron 100000% (cien mil porciento) más biomasa que las CDDs, y en cuanto al rendimiento de producción en estos tanques de 3 litros, las CMCs produjeron 8 veces más paclitaxel que las CDDs. Otra gran diferencia fue que las CMCs secretaban al medio de cultivo el 74% del paclitaxel que producían, mientras que las CDDs menos del 5%. Esto es una gran ventaja porque permite reducir los costos de purificación del producto que es lo más caro de todo el proceso. Aún así, falta mucho por investigar ya que se deben mejorar las células mediante la ingeniería genética y metabólica para aumentar sus rendimientos, de esta manera poder reducir los costos de producción, y por lo tanto, el precio del producto en e... Read more »

Lee, E., Jin, Y., Park, J., Yoo, Y., Hong, S., Amir, R., Yan, Z., Kwon, E., Elfick, A., Tomlinson, S.... (2010) Cultured cambial meristematic cells as a source of plant natural products. Nature Biotechnology, 28(11), 1213-1217. DOI: 10.1038/nbt.1693  

join us!

Do you write about peer-reviewed research in your blog? Use ResearchBlogging.org to make it easy for your readers — and others from around the world — to find your serious posts about academic research.

If you don't have a blog, you can still use our site to learn about fascinating developments in cutting-edge research from around the world.

Register Now

Research Blogging is powered by SMG Technology.

To learn more, visit seedmediagroup.com.